Der Apfel C2H2

Horticulture Research Band 8, Artikelnummer: 159 (2021) Diesen Artikel zitieren

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Jasmonsäure (JA) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Blattalterung. Die molekularen Mechanismen der Blattalterung beim Apfel (Malus Domestica) sind jedoch noch unklar. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass MdZAT10, ein Zink-Finger-Transkriptionsfaktor (TF) vom C2H2-Typ in Äpfeln, die Blattalterung deutlich beschleunigt und die Expression seneszenzbezogener Gene erhöht. Um zu untersuchen, wie MdZAT10 die Blattalterung fördert, führten wir ein Flüssigkeitschromatographie-/Massenspektrometrie-Screening durch. Wir haben festgestellt, dass MdABI5 physikalisch mit MdZAT10 interagiert. MdABI5, ein wichtiger positiver Regulator der Blattalterung, beschleunigte die Blattalterung bei Äpfeln deutlich. Es wurde festgestellt, dass MdZAT10 die Transkriptionsaktivität von MdABI5 für MdNYC1 und MdNYE1 steigert und so die Blattalterung beschleunigt. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die MdZAT10-Expression durch Methyljasmonat (MeJA) induziert wurde, was die JA-induzierte Blattalterung beschleunigte. Wir fanden auch heraus, dass das JA-responsive Protein MdBT2 direkt mit MdZAT10 interagiert und dessen Proteinstabilität durch Ubiquitinierung und Abbau verringert, wodurch die MdZAT10-vermittelte Blattalterung verzögert wird. Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Mechanismen, durch die MdZAT10 die JA-induzierte Blattalterung bei Äpfeln positiv reguliert.

Die Seneszenz der Pflanzenblätter, das letzte Stadium der Blattentwicklung, geht mit einer Reihe physiologischer und biochemischer Veränderungen einher, darunter dem Abbau intrazellulärer Organellen und der Hydrolyse von Makromolekülen zur Verlagerung von Nährstoffen und Energie in neu entstehende Gewebe oder Speicherorgane1. Es ist wichtig zu verstehen, wie Pflanzen den Seneszenzprozess regulieren, um größere Ertragsverluste in der Landwirtschaft zu verhindern. Der Blattalterungsprozess kann durch ungünstige Umwelteinflüsse, einschließlich längerer Dunkelheit, Trockenheit und Krankheitserregerbefall2,3,4, sowie durch endogene Faktoren wie Alter, Entwicklungsstadium und Pflanzenhormone5,6 ausgelöst und gefördert werden. Blattalterung hemmt die Photosynthesekapazität und verringert somit die Qualität und den Ertrag der Ernte7,8. Daher bietet die Verzögerung der Blattalterung potenzielle wirtschaftliche Vorteile7.

Es ist bekannt, dass Pflanzenhormone den Zeitpunkt der Blattalterung beeinflussen. Hormone wie Abscisinsäure (ABA), Jasmonsäure, Ethylen (ET) und Salicylsäure (SA) beschleunigen den Blattalterungsprozess, während Auxin, Cytokinine (CKs) und Gibberellinsäure (GA) die Blattalterung verzögern9. JA ist ein aus Lipiden gewonnenes Phytohormon, das im Pflanzenreich allgegenwärtig ist und eine wesentliche Rolle bei der Regulierung mehrerer physiologischer Prozesse in Pflanzen spielt, darunter Wurzelwachstum, Blattalterung und die Reaktion auf Verletzungen und Krankheitserreger10,11,12,13. Bei Arabidopsis ist der endogene JA-Gehalt in alternden Blättern höher als in nicht alternden Blättern14. Im Einklang mit diesem erhöhten JA-Gehalt werden mehrere am JA-Biosyntheseweg beteiligte Gene, wie LIPOXYGENASE 1/3/4 (LOX1/3/4) und ALLENE OXIDE CYCLASE 1 (AOC1), während der Blattalterung ebenfalls deutlich hochreguliert14. Als Reaktion auf JA interagieren die JASMONATE ZIM-DOMAIN (JAZ)-Proteine ​​mit CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1), einem Bestandteil des SCFCOI1-Komplexes15,16. Die JAZ-Proteine ​​werden dann vom 26S-Proteasom abgebaut, wodurch nachgeschaltete JA-responsive Gene wie der bHLH-Transkriptionsfaktor MYC216,17 freigesetzt werden. MYC2 reguliert die JA-induzierte Blattalterung positiv, indem es die Expression des SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 29 (SAG29) direkt aktiviert, und MYC2 interagiert mit den TFs der bHLH-Untergruppe IIId bHLH03, 13, 14 und 17, die die Blattalterung antagonistisch regulieren18.

Eine große Anzahl genetischer und Transkriptomstudien haben gezeigt, dass TFs den Blattalterungsprozess regulieren10,19. Einige TFs spielen eine entscheidende Rolle in Regulierungsnetzwerken für die Blattalterung. Zu diesen TFs gehören Mitglieder der Familien bHLH, NAC, MYB, WRKY, bZIP, Zinkfinger vom Typ C2H2 und AP2⁄EREBP19,20. Zinkfingerproteine ​​(ZFPs) vom Typ C2H2 sind eine große Familie von Transkriptionsregulatoren in Pflanzen21. Es ist bekannt, dass verschiedene Zinkfinger-TFs vom C2H2-Typ an der Pflanzenentwicklung und Stressreaktionen beteiligt sind22,23. Die meisten ZFPs enthalten ein bis vier hochkonservierte QALGGH-Motive24. Darüber hinaus enthalten einige ZFPs C-terminale ERF-assoziierte amphiphile Repressionsmotive (EAR), die als Transkriptionsrepressoren 25, 26 fungieren. Es wurde festgestellt, dass mehrere Mitglieder der Zinkfinger-TF-Familie vom C2H2-Typ während der natürlichen Blattalterung hoch- oder herunterreguliert werden19, was darauf hindeutet, dass Zinkfinger-TFs vom C2H2-Typ möglicherweise an der Blattalterung beteiligt sind. Arabidopsis-Zinkfinger-Protein 2 (AZF2), ein Zinkfinger-TF vom C2H2-Typ, reguliert positiv die altersbedingte Blattalterung27.

ABSCISIC ACID-INSENSITIVE5 (ABI5), ein TF vom Basis-Leucin-Zipper-Typ (bZIP), reguliert positiv die ABA-Signalisierung und ist an der Samenkeimung, der abiotischen Stresstoleranz und der Blattalterung beteiligt4,28,29. Frühere Studien haben gezeigt, dass ABI5 die Seneszenz von Blättern durch Transkriptionsregulation moduliert. ABI5 reguliert positiv die dunkelinduzierte Blattalterung, indem es die Expression des ABA-Response-Proteins (ABR)30 direkt unterdrückt und die Expression der Chlorophyllabbaugene NON-YELLOW COLORING1 (NYC1) und STAY-GREEN 1 (SGR1/NYE1)4 aktiviert. Die bHLH-TFs PHYTOCHROME-INTERACTING FACTORS 4/5 (PIF4/5) aktivieren ABI5 direkt während der dunkelinduzierten Seneszenz4. In Reis (Oryza sativa) aktiviert ONAC054 OsABI5 direkt als Reaktion auf die Blattalterung31. Eine aktuelle Studie ergab, dass MdABI5 an der ABA-induzierten Blattalterung beteiligt ist32. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ABI5 eine entscheidende Rolle im Prozess der Blattalterung spielt.

Frühere Studien haben mehrere Gene identifiziert, die die Blattalterung bei Äpfeln fördern oder verzögern33,34,35. In dieser Studie haben wir einen Zinkfinger-TF vom C2H2-Typ, MdZAT10, identifiziert und gezeigt, dass er die Blattalterung bei Äpfeln (Malus Domestica) positiv reguliert. Weitere Experimente zeigten, dass MdZAT10 mit MdABI5 interagiert und den MdABI5-vermittelten Blattalterungsprozess beschleunigt. Es wurde auch festgestellt, dass MdZAT10 die JA-induzierte Blattalterung beschleunigt. Wir haben einen negativen JA-Regulator, MdBT2, gefunden, der mit MdZAT10 interagiert und dessen Stabilität moduliert, wodurch die MdZAT10-vermittelte Blattalterung unterdrückt wird. Zusammenfassend haben wir Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet, um die Beziehungen zwischen MdBT2, MdZAT10 und MdABI5 während der Blattalterung darzustellen.

Die Expression einer großen Anzahl von TFs vom C2H2-Typ wird während der natürlichen Seneszenz deutlich induziert 19 . Das MdZAT10-Gen, ein Zinkfinger-TF vom C2H2-Typ in der Unterklasse C1-2i, ist homolog zu Arabidopsis STZ/ZAT10 (SALT TOLERANCE ZINC FINGER). Das MdZAT10-Gen (MDP0000198015) wurde durch eine BLAST-Suche in der Apfelgenomdatenbank (Apple Gene Function & Gene Family DataBase Version 1.0) identifiziert. Um zu ZAT10 homologe Proteine ​​zu identifizieren, wurde ein phylogenetischer Baum erstellt, der Sequenzen von 21 verschiedenen Pflanzenarten enthält. Alle Proteine ​​enthielten zwei konservierte Zinkfingerdomänen und ein EAR-Motiv, und MdZAT10 war hochgradig homolog zu PbZAT10 von Pyrus bretschneideri (ergänzende Abbildung S1).

Wir haben das Expressionsniveau von MdZAT10 in Apfelblättern in verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen, einschließlich der nichtseneszenten (NS), frühseneszenten (ES) und spätseneszenten (LS) Stadien. Die MdZAT10-Expression war im ES- und LS-Stadium höher als im NS-Stadium (Abb. 1a). Um die Funktion von MdZAT10 während der Blattalterung zu bestätigen, wurde ein MdZAT10-Überexpressionsvektor in Arabidopsis transformiert, wodurch drei unabhängige Arabidopsis-Linien (MdZAT10-L1, L2 und L3) erzeugt wurden (ergänzende Abbildung S2). Abgelöste Blätter von transgenen Arabidopsis-Sämlingen zeigten eine stärkere Blattvergilbung als die von Wildtyp-Sämlingen (Col) (Abb. 1b). In Übereinstimmung mit ihren Farbunterschieden zeigten die Blätter der transgenen Pflanzen eine signifikante Abnahme des Chlorophyllgehalts und der maximalen Quantenausbeute des Photosystems II (Fv/Fm) (Abb. 1c, d). Um diese Blattseneszenzphänotypen weiter zu bestätigen, wurden MdZAT10-Überexpressions- und Antisense-Unterdrückungsvektoren mithilfe eines vorübergehenden Expressionssystems in abgelöste Apfelblätter transformiert (ergänzende Abbildung S2). Konsistent zeigten Apfelblätter, die MdZAT10 überexprimierten, eine frühe Seneszenz, wohingegen Apfelblätter, die eine MdZAT10-Antisense-Unterdrückung exprimierten, eine verzögerte Seneszenz zeigten (Abb. 1e). Darüber hinaus zeigten die MdZAT10-Überexpressions- und Antisense-Unterdrückungsvektoren von Apfelblättern auch entsprechende Unterschiede im Chlorophyllgehalt (Abb. 1f). Wir fanden heraus, dass die Überexpression von MdZAT10 die Expression von MdNYC1 und MdNYE1 in Apfelblättern erhöhte (Abb. 1g, h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass MdZAT10 die Blattalterung positiv reguliert.

ein MdZAT10-Transkriptniveau in spät seneszierenden (LS), früh seneszenten (ES) und nicht seneszierenden (NS) Blättern. b Abgelöste Blätter von 3 Wochen alten Wildtyp-Pflanzen (Col) und drei transgenen Linien (MdZAT10-L1, L2 und L3) wurden 5 Tage lang in 3 mM MES-Puffer im Dunkeln inkubiert. c Der Chlorophyllgehalt und d Fv/Fm vor und nach der Dunkelbehandlung wurden bestimmt. e Blattseneszenz-Phänotyp und f der Gesamtchlorophyllgehalt von Apfelblättern, die vorübergehend einen leeren Vektor (EV) exprimieren und MdZAT10 oder MdZAT10-Antisense-Vektor im Dunkeln 15 Tage lang überexprimieren. g, h Die Expressionsniveaus von MdNYC1 und MdNYE1 in Apfelblättern nach 15 Tagen Dunkelbehandlung. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede an, die durch den T-Test ermittelt wurden (*P < 0,05, **P < 0,01)

Um den Mechanismus, durch den MdZAT10 die Blattalterung fördert, weiter zu untersuchen, wurde ein Flüssigchromatographie-/Massenspektrometrie-Assay (LC/MS) durchgeführt, um Proteine ​​zu screenen, die mit MdZAT10 interagieren, wobei MdZAT10-GFP als Köder verwendet wurde. Nach dem Screening wurde festgestellt, dass das MdABI5-Protein (GenBank-Zugangsnummer: LOC103430245) mit MdZAT10 interagiert, und ein Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) wurde durchgeführt, um diese Interaktion zu bestätigen. Die cDNA voller Länge von MdZAT10 wurde als Beute mit dem Vektor pGAD424 fusioniert (pGAD-MdZAT10) und die cDNA voller Länge von MdABI5 wurde als Köder mit dem Vektor pGBT9 fusioniert (pGBD-MdABI5). Die Plasmide pGAD-MdZAT10 und pGBD-MdABI5 wurden in Hefe cotransformiert. Die Ergebnisse zeigten eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen MdZAT10 und MdABI5 (Abb. 2a). Um die Regionen in MdZAT10 zu identifizieren, die mit MdAB15 interagieren, wurde MdZAT10 in Fragmente mit N-Terminus (MdZAT10-N) und C-Terminus (MdZAT10-C) unterteilt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Zinkfingerdomänen und das EAR-Motiv von MdZAT10 für die Interaktion zwischen MdZAT10 und MdABI5 wesentlich sind (Abb. 2a). MdZAT10 interagierte mit MdABI5, jedoch nicht mit MdABI1, MdABI2 oder MdABI4 (Abb. 2a, b); MdABI5 interagierte auch spezifisch mit MdZAT10, jedoch nicht mit anderen MdZATs (Abb. 2c). Darüber hinaus führten wir einen In-vitro-Pulldown-Assay durch und stellten fest, dass MdABI5-His durch das MdZAT10-GST-Fusionsprotein heruntergezogen werden konnte (Abb. 2d). Schließlich wurde in einem BiFC-Assay nur dann ein starkes Fluoreszenzsignal des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in den Kernen beobachtet, wenn MdZAT10-cYFP und MdABI5-nYFP in Blätter von Nicotiana benthamiana cotransformiert wurden (Abb. 2e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MdZAT10 physikalisch mit MdABI5 interagiert.

a Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) zeigte, dass MdZAT10 mit MdABI5 interagiert. MdZAT10-Sequenzen voller Länge und verkürzte MdZAT10-Sequenzen wurden in den pGAD424-Vektor kloniert. MdABI5 voller Länge wurde in den pGBT9-Vektor kloniert. Als Negativkontrolle wurde der leere pGAD-Vektor verwendet. b Ein Y2H-Assay zeigte, dass MdABIs (MdABI1, MdABI2 und MdABI4) und MdZAT10 interagieren. c Ein Y2H-Assay zeigte, dass MdABI5 mit MdZAT-Proteinen interagiert (MdAZF1, MdZAT5, MdZAT6, MdZAT10, MdZAT11, MdZAT14, MdZAT16 und MdZAT18). d In-vitro-MdZAT10- und MdABI5-Pulldown-Assay. Das MdABI5-His-Protein wurde mit MdZAT10-GST und GST inkubiert. Mit GST-Kügelchen heruntergezogene Proteine ​​wurden mithilfe von Anti-GST- und Anti-His-Antikörpern nachgewiesen. e BiFC-Assay. Die MdZAT10-cYFP- und MdABI5-nYFP-Konstrukte wurden vorübergehend in Blättern von Nicotiana benthamiana exprimiert und das Fluoreszenzsignal wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Kerne werden durch DAPI-Färbung angezeigt. Maßstabsbalken, 10 μm

Frühere Studien haben berichtet, dass MdABI5 die ABA-induzierte Blattalterung reguliert . Wir haben das Expressionsniveau von MdABI5 in Apfelblättern in verschiedenen Entwicklungsstadien nachgewiesen. Das MdABI5-Expressionsniveau war im ES- und LS-Stadium höher als im NS-Stadium (ergänzende Abbildung S3). Um die Rolle von ABI5 während der Blattalterung aufzuklären, wurde ein MdABI5-Überexpressionsvektor in Arabidopsis transformiert, wodurch drei einzelne transgene Linien (MdABI5-L1, L2 und L3) erzeugt wurden (ergänzende Abbildung S2). Die Überexpression von MdABI5 förderte deutlich die Blattvergilbung und reduzierte den Chlorophyllgehalt und Fv/Fm nach 5 Tagen im Dunkeln (ergänzende Abbildung S3). Darüber hinaus wurden die MdABI5-Überexpressions- und MdABI5-Antisense-Unterdrückungsvektoren vorübergehend in abgelöste Apfelblätter transformiert. Apfelblätter, die MdABI5 überexprimierten, zeigten einen stärkeren Seneszenzphänotyp und einen geringeren Chlorophyllgehalt, wohingegen die MdABI5-Antisense-Unterdrückung einen verzögerten Seneszenzphänotyp und einen höheren Chlorophyllgehalt zeigte (ergänzende Abbildung S3). Frühere Studien haben gezeigt, dass ABI5 die Blattalterung induziert, indem es die Expression der Chlorophyllabbaugene NYC1 und NYE14,31 direkt reguliert. In dieser Studie wurde die Expression von MdNYC1 und MdNYE1 in Apfelblättern verstärkt, die MdABI5 überexprimierten (ergänzende Abbildung S3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass MdABI5 die Blattalterung fördert.

Angesichts der Wechselwirkung zwischen MdZAT10 und MdABI5 vermuteten wir, dass MdZAT10 an der MdABI5-vermittelten Blattalterung beteiligt ist. Eine Arabidopsis-Linie, die MdZAT10 überexprimiert, wurde mit einer Arabidopsis-Linie, die MdABI5 überexprimiert, gekreuzt. Die resultierenden Arabidopsis-Pflanzen, die MdZAT10/MdABI5 überexprimierten, verfärbten sich viel schneller gelb und hatten einen geringeren Chlorophyllgehalt als die Pflanzen, die MdABI5 allein überexprimierten (Abb. 3a, b). In Übereinstimmung mit dem beobachteten Phänotyp bei Arabidopsis erhöhte die Überexpression von MdZAT10 die MdABI5-vermittelte Blattalterung in Apfelblättern (Abb. 3c, d). Diese Ergebnisse zeigten, dass MdZAT10 die durch MdABI5 geförderte Blattalterung beschleunigt.

a Phänotyp der Blattseneszenz und b Gesamtchlorophyllgehalt abgelöster Blätter von transgenen Arabidopsis-Stämmen Col, MdABI5-L2 und MdZAT10-L1/MdABI5-L2, die 5 Tage lang auf 3 mM MES-Puffer im Dunkeln schwammen. c Phänotyp der Blattseneszenz und d Gesamtchlorophyllgehalt von Apfelblättern, die vorübergehend einen leeren Vektor (EV) exprimieren, MdABI5 allein überexprimieren oder MdZAT10 und MdABI5 überexprimieren, die 14 Tage lang im Dunkeln auf 3 mM MES-Puffer schweben gelassen wurden. e, f Die Expressionsniveaus von MdNYC1 und MdNYE1 in Wildtyp-(WT)-Kalli und transgenen MdABI5-OX-, MdZAT10-OX-, MdZAT10-OX/MdABI5-OX-Kalli wurden mittels qRT-PCR-Assay gemessen. g Schematische Darstellung von Reporter- und Effektorkonstrukten. h, i Ein Luciferase-Assay zeigte, dass eine vorübergehende Cotransformation von MdZAT10 und MdABI5 in Tabakblätter die Expression von MdNYC1 und MdNYE1 aktivierte. Der leere Vektor (SK + LUC) diente als Negativkontrolle. Das LUC/REN-Verhältnis stellt die Fähigkeit von MdABI5 dar, die MdNYC1- und MdNYE1-Expression zu aktivieren. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P < 0,05, **P < 0,01 an

Daher stellten wir die Hypothese auf, dass MdZAT10 die Transkriptionsaktivierung von MdNYC1 und MdNYE1 durch MdABI5 beeinflusst. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde die Genexpression in den Kalli transgener Apfelpflanzen, die MdABI5 (MdABI5-OX) überexprimieren, nachgewiesen (ergänzende Abbildung S2). Wir fanden heraus, dass die MdNYC1- und MdNYE1-Expression in MdABI5-OX-Kalli dramatisch hochreguliert war. Der MdZAT10-Überexpressionsvektor wurde in MdABI5-überexprimierende transgene Kalli eingeführt, und die resultierenden transgenen MdZAT10-OX/MdABI5-OX-Kalli zeigten eine deutlich erhöhte MdNYC1- und MdNYE1-Expression (Abb. 3e, f). Um dieses Ergebnis zu bestätigen, führten wir einen transienten Expressionstest in Tabakblättern durch. Die Promotorfragmente von MdNYC1 und MdNYE1 wurden in den pGreenII 0800-LUC-Reporter (pMdNYC1-LUC, pMdNYE1-LUC) fusioniert, und MdZAT10 und MdABI5 wurden in das Effektorkonstrukt pGreenII 62-SK (MdZAT10-SK, MdABI5-SK) fusioniert. Wir fanden heraus, dass MdABI5 die Promotoren von MdNYC1 und MdNYE1 aktivierte und eine stärkere Wirkung hatte, wenn MdZAT10 und MdABI5 cotransformiert wurden (Abb. 3g – i). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Interaktion zwischen MdZAT10 und MdABI5 die Transkriptionsaktivität von MdABI5 für MdNYC1 und MdNYE1 steigert.

Wir fanden auch heraus, dass MdZAT10 durch MeJA induziert wurde (Abb. 4a). Um die Funktion von MdZAT10 als Reaktion auf JA weiter zu bestätigen, produzierten wir transgene Apfelkalli, die β-Glucuronidase (GUS) exprimierten, gesteuert durch eine Region 2 kb stromaufwärts des MdZAT10-Gens. Die histochemische Färbung zeigte, dass die MeJA-Behandlung die GUS-Aktivität signifikant erhöhte (Abb. 4b, c). Abgelöste Blätter von transgenen MdZAT10-Arabidopsis zeigten bei MeJA-Behandlung eine verstärkte Blattvergilbung (Abb. 4d). Der Chlorophyllgehalt in diesen Blättern war im Vergleich zu den Blättern von Col-Pflanzen deutlich reduziert (Abb. 4e). Konsistent zeigten Apfelblätter, die MdZAT10 überexprimierten, nach der MeJA-Behandlung ebenfalls eine frühe Seneszenz, wohingegen die Unterdrückung von MdZAT10-Antisense eine verzögerte Seneszenz zeigte (Abb. 4f). Darüber hinaus zeigten die Blätter der MdZAT10-Überexpression und der MdZAT10-Antisense-Unterdrückung unterschiedliche Chlorophyllgehalte (Abb. 4g). Diese Ergebnisse zeigten, dass MdZAT10 als positiver Regulator der JA-induzierten Blattalterung bei Äpfeln fungiert.

ein Transkriptniveau von MdZAT10 als Reaktion auf 100 μM MeJA. b GUS-Färbung und c GUS-Aktivität in transgenen proMdZAT10::GUS-Kalli mit (MeJA) oder ohne (Mock) 100 µM MeJA-Behandlung für 12 Stunden. d Blattseneszenzphänotyp und e Chlorophyllgehalt abgelöster Blätter von 3 Wochen altem Col und transgenen Arabidopsis MdZAT10-L1, L2 und L3, die 3 Tage lang auf 3 mM MES-Puffer mit oder ohne 100 μM MeJA flotierten. f Blattseneszenzphänotyp und g Chlorophyllgehalt von Apfelblättern, die vorübergehend einen leeren Vektor (EV) exprimieren und MdZAT10 oder MdZAT10-Antisense-Vektor überexprimieren, der 14 Tage lang auf 3 mM MES-Puffer mit oder ohne 100 μM MeJA flotierte. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede im t-Test an (*P < 0,05, **P < 0,01)

Zusätzlich zu seiner Transkriptionsregulation fanden wir heraus, dass MdZAT10 als Reaktion auf die MeJA-Behandlung auf posttranslationaler Ebene reguliert wurde. Ein In-vitro-Proteinabbautest wurde durchgeführt, um den Proteingehalt von MdZAT10 als Reaktion auf die MeJA-Behandlung zu messen. Das Fusionsprotein MdZAT10-His wurde mit Gesamtprotein aus Apfelkalli mit oder ohne MeJA-Behandlung inkubiert. Der MdZAT10-His-Spiegel sank ohne MeJA-Behandlung schnell, der Abfall des MdZAT10-Proteinspiegels wurde jedoch durch die Behandlung mit MeJA oder dem 26S-Proteasom-Inhibitor MG132 deutlich aufgehoben (ergänzende Abbildung S4a). Darüber hinaus stieg der MdZAT10-Proteinspiegel in MdZAT10-überexprimierenden transgenen Apfelkalli mit der MeJA-Behandlung an (ergänzende Abbildung S4b). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit von MeJA den MdZAT10-Proteinabbau über den 26S-Proteasomweg reduzierte.

Zusätzlich zu MdABI5 wurde MdBT2 als potenzielles Interaktionsprotein von MdZAT10 untersucht. MdBT2 spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der JA-vermittelten Blattalterung36. Wir verwendeten einen Y2H-Assay, um zu bestimmen, ob MdBT2 und MdZAT10 interagieren. Die cDNA voller Länge von MdBT2 wurde als Köder mit dem pGBT9-Vektor fusioniert (pGBD-MdBT2). Nur Hefezellen, die pGAD-MdZAT10 und pGBD-MdBT2 enthielten, wuchsen gut auf -Trp/-Leu/-His/-Ade-Screeningmedium (Abb. 5a). Um die Regionen von MdBT2 zu bestimmen, die mit MdZAT10 interagieren, wurde MdBT2 in N-terminale (MdBT2-N) und C-terminale (MdBT2-C) Fragmente unterteilt. Wie in Abb. 5b gezeigt, waren die BTB- und TAZ-Domänen von MdBT2 für diese Interaktion unverzichtbar (Abb. 5b). Um zu bestimmen, ob MdBT2 spezifisch mit MdZAT10 interagiert, wurden sieben ZFPs vom Apfel-C2H2-Typ (MdAZF1, MdZAT5, MdZAT6, MdZAT11, MdZAT14, MdZAT16 und MdZAT18) mit dem Beutevektor pGAD424 fusioniert. Allerdings konnten sie alle nicht mit MdBT2 interagieren (ergänzende Abbildung S5). MdBT1, MdBT2, MdBT3.1 und MdBT4 sind wichtige Mitglieder der Apfel-MdBT-Proteinfamilie, und MdBT1 und MdBT2 interagieren mit MdZAT10 (ergänzende Abbildung S5).

a, b Ein Y2H-Assay zeigte die Wechselwirkung zwischen MdZAT10 und MdBT2. Vollständige und verkürzte MdZAT10- und MdBT2-Sequenzen wurden in die pGBD- und pGAD-Vektoren kloniert. c In-vitro-Pulldown-Assay mit MdZAT10 und MdBT2. Das MdZAT10-His-Protein wurde mit GST-MdBT2 und GST inkubiert. Proteine, die mit GST-Perlen heruntergezogen wurden, wurden mithilfe von Anti-GST- und Anti-His-Antikörpern nachgewiesen. d BiFC-Assay. Die MdZAT10-cYFP- und MdBT2-nYFP-Konstrukte wurden vorübergehend in Blättern von Nicotiana benthamiana exprimiert, und das Fluoreszenzsignal im Zellkern wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Kerne werden durch DAPI-Färbung angezeigt. Maßstabsbalken, 10 μm

Die MdBT2-MdZAT10-Wechselwirkung wurde durch Pulldown- und BiFC-Assays weiter verifiziert. Für den Pull-Down-Assay wurden das Fusionsprotein MdBT2-GST und GST als Kontrolle mit dem Fusionsprotein MdZAT10-His inkubiert. Nur MdBT2-GST konnte MdZAT10-His herunterziehen (Abb. 5c). Als nächstes führten wir einen BiFC-Assay durch, um die Wechselwirkung weiter zu bestätigen. MdZAT10 und MdBT2 wurden an die C-terminalen (cYFP) bzw. N-terminalen (nYFP) Regionen des gelb fluoreszierenden Proteins fusioniert. Wie in Abb. 5d gezeigt, wurde ein starkes Fluoreszenzsignal im Zellkern nachgewiesen, als MdZAT10-cYFP und MdBT2-nYFP in N. benthamiana-Blätter injiziert wurden, wohingegen bei den Negativkontrollen kein YFP-Fluoreszenzsignal festgestellt wurde. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass MdBT2 physikalisch mit MdZAT10 interagiert.

Aktuelle Studien haben gezeigt, dass MdBT2 die Stabilität seiner Zielproteine ​​durch Ubiquitinierung im Allgemeinen negativ reguliert37,38. Wir inkubierten das MdZAT10-His-Fusionsprotein mit Gesamtprotein aus Apfelkalli, die mit oder ohne den Proteasom-Inhibitor MG132 behandelt wurden. Die Proteinstabilität von MdZAT10 wurde durch MG132 erhöht, was darauf hinweist, dass das MdZAT10-Protein über den 26S-Proteasomweg abgebaut wird (ergänzende Abbildung S4).

Dann spekulierten wir, dass MdBT2 die Stabilität des MdZAT10-Proteins vermittelt. Um diese Spekulation zu bestätigen, haben wir transgene MdBT2-überexprimierende und Antisense-Apfelkalli (MdBT2-OX und MdBT2-Anti) erzeugt. Ein zellfreier MdZAT10-Abbautest wurde durch Inkubation von MdZAT10-His mit Gesamtprotein durchgeführt, das aus Wildtyp-, MdBT2-OX- und MdBT2-Anti-Kalli extrahiert wurde. Wie in Abb. 6a gezeigt, verlief der Abbau des MdZAT10-His-Proteins in den MdBT2-OX-Kalli viel schneller als in den Wildtyp-Kalli, wohingegen MdZAT10-His in den MdBT2-Anti-Kalli langsamer abgebaut wurde. Allerdings unterdrückte der Proteasom-Inhibitor MG132 den Abbau des MdZAT10-His-Proteins deutlich (Abb. 6a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das MdZAT10-Protein über den 26S-Proteasom-Weg abgebaut wird, und ein Ubiquitinierungsassay wurde durchgeführt, um diesen Befund weiter zu verifizieren. Das aus MdBT2-GFP-Kalli und GFP extrahierte Gesamtprotein wurde mit dem MdZAT10-His-Protein inkubiert. Das ubiquitinierte MdZAT10-His-Protein wurde mithilfe von Anti-His- und Anti-Ubi-Antikörpern bewertet. In der MdBT2-GFP + MdZAT10-His-Mischung wurde eine größere Menge an hochmolekularem MdZAT10-His nachgewiesen (Abb. 6b). Um zu bestätigen, dass MdBT2 den Abbau von MdZAT10 in vivo fördert, haben wir transgene Apfelkalli 35S::MdZAT10-GFP und 35S::MdZAT10-GFP + 35S::MdBT2-OX generiert. Western Blot wurde mit einem Anti-GFP-Antikörper durchgeführt und die MdZAT10-GFP-Proteinhäufigkeit war in den transgenen 35S::MdZAT10-GFP + 35S::MdBT2-OX-Kalli geringer (Abb. 6c). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass MdBT2 den Abbau des MdZAT10-Proteins vermittelt.

ein zellfreier MdZAT10-His-Abbautest. Das MdZAT10-His-Fusionsprotein wurde für die angegebenen Zeiträume mit Gesamtprotein inkubiert, das aus transgenen Wildtyp- (WT), MdBT2-OX- und MdBT2-Anti-Kalli extrahiert wurde. b MdBT2 ubiquitinierte das MdZAT10-His-Protein in vivo. MdZAT10-His wurde mit einem Anti-His-Antikörper immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-His- und Anti-Ubi-Antikörpern untersucht. IP, Immunpräzipitat; IB, Immunoblot; Ubi, Ubiquitin. c Die MdZAT10-GFP-Proteinhäufigkeit in transgenen Apfelkalli (MdZAT10-GFP und MdZAT10-GFP/MdBT2-OX) wurde durch Immunblotting unter Verwendung eines Anti-GFP-Antikörpers bewertet

Frühere Studien haben gezeigt, dass MdBT2 die JA-induzierte Blattalterung verzögert. Angesichts der Tatsache, dass MdBT2 die Ubiquitinierung von MdZAT10 fördert, spekulierten wir, dass MdBT2 an der Regulierung der durch MdZAT10 geförderten Blattalterung beteiligt ist. Um die mögliche Funktion von MdBT2 bei der Blattalterung zu untersuchen, haben wir drei transgene Arabidopsis-Linien (MdBT2-L1, L2 und L3) und transgene Apfelpflanzen erhalten, die BT2 (MdBT2-OE-L1 und MdBT2-OE-L5) und BT2-Antisense überexprimieren ( MdBT2-Anti-L13 und MdBT2-Anti-L23) (Ergänzende Abbildung S2). MdBT2-überexprimierende Blätter sowohl von Arabidopsis als auch von Äpfeln zeigten einen verzögerten Seneszenzphänotyp, wohingegen MdBT2-Antisense-Pflanzen eine beschleunigte JA-induzierte Blattalterung zeigten. Der Chlorophyllgehalt stimmte mit dem Phänotyp überein (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. S6). Die MdZAT10 überexprimierende Arabidopsis-Linie wurde mit der MdBT2 überexprimierenden Arabidopsis-Linie gekreuzt. Die resultierenden Arabidopsis-Pflanzen, die MdZAT10/MdBT2 überexprimierten, zeigten im Vergleich zu Pflanzen, die MdZAT10 überexprimierten, eine verzögerte Blattalterung und einen erhöhten Chlorophyllgehalt (Abb. 7c, d). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen verringerte die Überexpression von MdBT2 den durch MdZAT10 geförderten Phänotyp der Blattseneszenz in Apfelblättern und erhöhte den Chlorophyllgehalt (Abb. 7e, f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass MdBT2 die durch MdZAT10 geförderte Blattalterung verzögert.

a Phänotyp der Blattseneszenz und b Chlorophyllgehalt von abgelösten Blättern von Wildtyp- (GL-3) und transgenen Apfelsämlingen, die MdBT2 (MdBT2-OE-L1, MdBT2-OE-L5) und MdBT2-Antisense (MdBT2-Anti-L13, MdBT2) überexprimieren -Anti-L23), die 12 Tage lang auf 3 mM MES-Puffer mit 100 μM MeJA im Dunkeln flotiert wurden. c Phänotyp der Blattseneszenz und d Chlorophyllgehalt von abgelösten Blättern von Col und transgenen Arabidopsis MdZAT10-L1, MdZAT10-L1/MdBT2-L1 und MdZAT10-L1/MdBT2-L2, die 6 Tage lang auf 3 mM MES-Puffer im Dunkeln geschwommen wurden . e Blattseneszenzphänotyp und f Chlorophyllgehalt von Apfelblättern, die vorübergehend einen leeren Vektor (EV) exprimierten oder MdZAT10 allein oder MdZAT10 und MdBT2 überexprimierten, wurden 13 Tage lang im Dunkeln auf 3 mM MES-Puffer schweben gelassen. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P < 0,05, **P < 0,01 an

Blattalterung ist ein komplexer Prozess, der den Abbau zellulärer Bestandteile wie Chloroplasten beinhaltet39. Das sichtbarste Merkmal der Seneszenz von Pflanzen, das mit dem Abbau enormer Mengen an Chlorophyll einhergeht, ist die Blattvergilbung. Blattalterung wirkt sich auch auf die Pflanzenproduktivität und die Pflanzengesundheit aus40. Viele TFs zeigen Expressionsänderungen während der Blattalterung41. In dieser Studie haben wir einen Zinkfinger-TF vom C2H2-Typ, MdZAT10, identifiziert, der die dunkel- und JA-induzierte Blattalterung positiv reguliert.

STZ/ZAT10 ist ein Mitglied der Zinkfinger-TF-Familie vom C2H2-Typ in der Unterklasse C1-2i, die an verschiedenen abiotischen Stressfaktoren wie Dürre, Salzgehalt, Kälte und osmotischem Stress beteiligt ist42,43,44,45,46. Darüber hinaus spielt es eine zentrale Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung47. Frühere Studien zeigten, dass während der Seneszenz in Arabidopsis mehrere Zinkfinger-TFs vom C2H2-Typ induziert werden . AZF2 fungiert als positiver Regulator der altersabhängigen Blattalterung, und der Verlust der AZF2-Funktion verzögert die Blattalterung27. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die MdZAT10-Expression in seneszenten Blättern höher ist als in jungen Blättern (Abb. 1) und dass eine Überexpression von MdZAT10 die Blattalterung beschleunigte (Abb. 1). Wir haben weiter untersucht, wie MdZAT10 die Seneszenz der Blätter fördert, und die Expressionsniveaus einiger seneszenzbezogener Gene gemessen. Transgene MdZAT10-OX-Kalli zeigten eine signifikant erhöhte Expression der Seneszenz-bezogenen Gene MdSAG29 und MdPAO und regulierten die Expression von MdWRKY70 und MdAPX2 herunter (ergänzende Abbildung S7). Die Überexpression von SAG29 in Arabidopsis beschleunigte die Blattalterung48. SAG29 fungiert als Zielgen von MYC2 und ist an der JA-induzierten Blattalterung beteiligt. Phäophorbid-A-Oxygenase (PAO) wird durch natürliche Seneszenz induziert, und die pao1-Mutante weist einen bleibend grünen Phänotyp auf49. Bei Arabidopsis reguliert WRKY70 die altersabhängige Blattalterung50 negativ. APX2 (ASCORBATE PEROXIDASE2) kodiert für zytosolisches APX2, das eine Schlüsselrolle bei der Entfernung von H2O251 spielt. H2O2 ist der am häufigsten verwendete Auslöser der Blattalterung52. Es wurde berichtet, dass erhöhte Werte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Blattalterung beschleunigen53,54,55. Es ist möglich, dass MdZAT10 die Seneszenz der Blätter fördert, indem es das Auffangen von ROS reduziert oder die Expression seneszenzbezogener Gene reguliert.

Darüber hinaus fanden wir heraus, dass MdZAT10 die JA-induzierte Blattalterung fördert. MdZAT10 wurde durch MeJA-Behandlung induziert, und transgene MdZAT10-OX-Kalli zeigten eine verstärkte Expression von MdAOC1 und MdAOS (ALLENOXID-SYNTHASE) (ergänzende Abb. S7). AOC1 und AOS sind mit dem JA-Biosyntheseweg verbunden und ihre Expression wird während der Blattalterung hochreguliert10. In Arabidopsis bindet MYC2 den Promotor von STZ/ZAT10 und reguliert dessen Expression56. STZ/ZAT10 und AZF2 können den LOX3-Promotor binden, um die frühe Reaktion auf MeJA57 zu regulieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass STZ/ZAT10 an der JA-Signalisierung beteiligt ist.

Zusätzlich zur Regulierung nachgeschalteter Gene kann MdZAT10 die Blattalterung durch Interaktion mit anderen Proteinen regulieren. Hier haben wir gezeigt, dass MdZAT10 mit MdABI5 interagiert (Abb. 2). ABI5 reguliert die durch Dunkelheit und ABA induzierte Blattalterung4,30,32,58. Jüngste Studien haben gezeigt, dass ABI5 die Photosynthese und Chloroplastenentwicklung bei Dunkelheit negativ reguliert4,58. RNA-seq-Daten zeigten, dass StABI5 das Expressionsniveau von Genen, die mit der Photosynthese in Zusammenhang stehen, negativ reguliert58. ABI5 reguliert die Blattalterung positiv, indem es die Expression von ABR30 direkt unterdrückt und die Expression von NYC1 und NYE14,31,58 aktiviert. Hier zeigten unsere Daten, dass MdABI5-überexprimierende transgene Pflanzen eine verstärkte Blattalterung zeigten und dass die MdABI5-Antisense-Unterdrückung die Blattalterung verzögerte (ergänzende Abbildung S3). MdABI5 aktivierte die Expression von MdNYC1 und MdNYE1 in MdABI5-OX-transgenen Apfelkalli und bestätigte damit die positive Regulierung der Blattalterung durch MdAB15 (Abb. 3). Wir fanden heraus, dass MdZAT10 die MdABI5-vermittelte Blattalterung beschleunigte und die Transkriptionsaktivierung von MdNYC1 und MdNYE1 durch MdABI5 erhöhte (Abb. 3). Es ist möglich, dass MdZAT10 die Seneszenz der Blätter fördert, indem es mit MdABI5 interagiert, um die Transkriptionsaktivität von MdABI5 für Zielgene zu beeinflussen.

Neben MdABI5 interagiert MdZAT10 auch mit MdBT2. MdBT2 verzögerte die JA-induzierte Blattalterung und MdBT2 verzögerte die durch MdZAT10 geförderte Blattalterung (Abb. 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MdBT2 eine entgegengesetzte Rolle bei der durch MdZAT10 geförderten Blattalterung spielt. Ubiquitinierung ist in großem Umfang an pflanzenbiologischen Prozessen beteiligt20. Mehrere Studien haben gezeigt, dass einige E3-Ligasen über den 26S-Proteasomweg an der Blattalterung beteiligt sind59. Eine aktuelle Studie ergab, dass MdBT2 mit MdMYC2 und MdJAZ2 interagiert und dadurch die JA-induzierte Blattalterung reguliert36. BT2 ist ein Bestandteil des CRL3-Komplexes, der die Ubiquitinierung des Zielproteins fördert60. Unsere Ergebnisse zeigten, dass MdBT2 den Abbau von MdZAT10 förderte und die JA-induzierte Blattalterung verzögerte (Abb. 5–7). In Gegenwart von JA wurde der Abbau von MdBT2 gefördert36, wodurch MdZAT10 aus dem MdBT2-vermittelten Abbau befreit wurde. Unsere Ergebnisse geben Einblick in die molekularen Mechanismen, durch die BT2 die JA-induzierte Blattalterung vermittelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MdBT2 die JA-induzierte Blattalterung dynamisch reguliert, indem es verschiedene Zielproteine ​​reguliert. Obwohl MdZAT10 mit MdBT2 und MdABI5 interagiert, ist unklar, ob diese beiden Interaktionen zusammenhängen. Die gleiche Region von MdZAT10 interagiert mit MdBT2 und MdABI5, und sowohl MdBT2 als auch MdABI5 interagieren mit MdZAT10 voller Länge (Abb. 2 und 5). Es ist möglich, dass MdBT2 und MdABI5 kompetitiv mit MdZAT10 interagieren, um die Blattalterung antagonistisch zu regulieren, diese Hypothese bedarf jedoch einer weiteren Überprüfung.

Zusammenfassend wird ein Arbeitsmodell zur Zusammenfassung der Rolle von MdZAT10 bei der Blattalterung vorgeschlagen (Abb. 8). Einerseits reguliert MdZAT10 durch seine Wechselwirkung mit MdABI5 positiv die Blattalterung und erhöht so die Transkriptionsaktivität von MdABI5 für die Chlorophyllabbaugene MdNYC1 und MdNYE1. Andererseits interagiert MdBT2 in Abwesenheit von MeJA mit MdZAT10 und ubiquitiniert MdZAT10, um MdZAT10 abzubauen, wodurch die durch MdZAT10 geförderte Blattalterung negativ reguliert wird. Im Gegensatz dazu wird MdZAT10 durch exogenes MeJA induziert, das die Blattalterung fördert. MeJA beschleunigt den Abbau von MdBT2 und setzt MdZAT10 frei, das zur JA-induzierten Blattalterung beiträgt. In dieser Studie haben wir die Rolle von MdZAT10 im regulatorischen Netzwerk der Blattseneszenz durch seine direkte Interaktion mit MdBT2 und MdABI5 charakterisiert.

Einerseits reguliert MdZAT10 die Blattalterung positiv, indem es mit MdABI5 interagiert und so die Transkriptionsaktivität von MdABI5 für MdNYC1 und MdNYE1 erhöht. Andererseits interagiert MdBT2 in Abwesenheit von JA mit MdZAT10 und ubiquitiniert MdZAT10, um MdZAT10 abzubauen, wodurch die durch MdZAT10 geförderte Blattalterung negativ reguliert wird. In Gegenwart von JA beschleunigt JA den Abbau von MdBT2 und setzt MdZAT10 frei, das zur JA-induzierten Blattalterung beiträgt.

In dieser Studie wurden Gewebekulturen von Äpfeln (Malus × Domestica „GL-3“) verwendet. Die Apfelsämlinge wurden auf MS-Medium, ergänzt mit 0,6 mg L-1 6-BA, 0,2 mg L-1 GA und 0,2 mg L-1 NAA, unter Langtagbedingungen (25 °C, 16/8 h hell/dunkel) subkultiviert ) und in 30-Tage-Intervallen subkultiviert. In dieser Studie wurden auch „Orin“-Apfelkalli (Malus Domestica Borkh.) verwendet. Die Kalli wurden auf MS-Medium, ergänzt mit 1,5 mg L-1 2,4-D und 0,4 mg L-1 6-BA, bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen kultiviert und in Abständen von 15 Tagen subkultiviert. Die Apfelkalli wurden zur genetischen Transformation verwendet. Sämlinge des Arabidopsis thaliana-Ökotyps Columbia wurden bei 22 °C unter Langtagbedingungen (16/8 Stunden Licht/Dunkelheit) gezüchtet. Arabidopsis-Sämlinge wurden zur genetischen Transformation und funktionellen Identifizierung verwendet.

Um Überexpressionsvektoren zu konstruieren, wurden die kodierenden Sequenzen voller Länge von MdBT2 und MdABI5 in den pCXCN-Myc-Vektor kloniert, und die kodierende Sequenz voller Länge MdZAT10 wurde in den pRI-101-Vektor (mit einem GFP-Tag) kloniert. Um Antisense-Suppressionsvektoren (MdBT2-Anti, MdABI5-Anti und MdZAT10-Anti) zu erzeugen, wurden Fragmente der MdBT2-, MdABI5- und MdZAT10-Sequenzen in den pRI-101-Vektor kloniert. Transgene MdBT2-GFP-Apfelkalli wurden wie in unserer vorherigen Studie beschrieben erhalten. Um das proMdZAT10:GUS-Konstrukt zu erzeugen, wurde das Promotorfragment von MdZAT10 in den pCAMBIA1300-GUS-Vektor eingefügt, der dann in Apfelkalli transformiert wurde. Transgene Apfelsämlinge, Apfelkalli und Arabidopsis-Sämlinge wurden gemäß zuvor beschriebenen Methoden erhalten61,62. Die transienten Transformations-Apfelblätter wurden gemäß einer zuvor beschriebenen Methode62 erhalten. Alle für die Genklonierung verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde aus Apfelsämlingen, Apfelkalli, Arabidopsis-Keimlingen und behandelten Sämlingen mit dem RNAplant Plus-Kit (TIANGEN) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Erststrang-cDNA wurde mit dem PrimeScript™ RT Reagent Kit (TaKaRa) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. qRT-PCR wurde auf einem StepOnePlus-Gerät (Applied Biosystems) unter Verwendung von UltraSYBR Mixture (Takara) durchgeführt. Alle Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Für jedes Experiment wurden drei biologische Replikate und drei technische Replikate durchgeführt.

Ein LC/MS-Assay wurde mit dem MdZAT10-GFP-Protein durchgeführt, um MdZAT10-interagierende Proteine ​​wie zuvor beschrieben auszusortieren63. Das MdZAT10-GFP-Protein wurde aus MdZAT10-überexprimierenden transgenen Kalli extrahiert und unter Verwendung eines Pierce Classic IP Kit (Thermo Fisher) gereinigt. Das MdZAT10-GFP-Protein wurde 6 Stunden lang mit dem aus Apfelsämlingen extrahierten Gesamtprotein inkubiert. Die gemischten Proteinlösungen wurden mit Protein A/G-Agarosekügelchen und Anti-GFP-Antikörper gemäß einem Standard-Co-Immunpräzipitationsprotokoll inkubiert. Anschließend wurde das Harz eluiert und die eluierten Proteine ​​auf SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Die Proteinidentifizierung erfolgte mittels LC-MS/MS (OE Biotech, Shanghai, China).

Um die Wechselwirkungen zwischen MdZAT10 und MdABI5 sowie MdBT2 und MdZAT10 zu bestätigen, wurden die kodierenden Sequenzen von MdZAT10, MdABI5 und MdBT2 in die Vektoren pGAD424 und pGBT9 kloniert, um pGAD-MdZAT10, pGBD-MdABI5 und pGBD-MdBT2 zu bilden. Verkürzte MdZAT10-Sequenzen (Aminosäuren 1–207 und 191–270) wurden in pGAD424 kloniert. Die verkürzten MdBT2-Sequenzen wurden auch in pGBT937 kloniert. Wir haben einen Y2H-Assay wie zuvor beschrieben64 durchgeführt. Die Plasmide pGBD-MdABI5 und pGBD-MdBT2 wurden einzeln mit pGAD-MdZAT10 in den Hefestamm Y2H Gold (Clontech) transformiert. Hefetransformanten wurden auf SD-Base/-Leu/-Trp-Medium gezüchtet und dann für Interaktionen auf SD-Base/-Leu/-Trp/-His/-Ade-Medium übertragen.

Die kodierenden Sequenzen voller Länge von MdZAT10, MdBT2 und MdABI5 wurden in die Vektoren pET32a und pGEX4T-1 kloniert, um die rekombinanten Konstrukte MdZAT10-pET32a, MdZAT10-pGEX 4T-1, MdABI5-pET32a und MdBT2-pGEX 4T-1 zu erzeugen . Die Konstrukte wurden in Escherichia coli BL21 (DE3) eingeführt, wonach die Fusionsproteine ​​MdZAT10-His, MdZAT10-GST, MdABI5-His und MdBT2-GST durch Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) erzeugt wurden ). Die eluierten Proteine ​​wurden durch Western Blot mit Anti-GST- und Anti-His-Antikörpern (Abmart, Shanghai, China) nachgewiesen.

Die kodierenden Sequenzen von MdZAT10, MdBT2 und MdABI5 wurden in die Vektoren 35S::pSPYCE-cYFP und 35S::pSPYNE-nYFP kloniert, um MdZAT10-cYFP, MdBT2-nYFP und MdABI5-nYFP zu erzeugen. Die rekombinanten Konstrukte wurden in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformiert und dann in N. benthamiana-Blätter injiziert. YFP-Fluoreszenzsignale wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss) erfasst.

Um den Phänotyp der Blattseneszenz zu untersuchen, wurden abgelöste Blätter im Dunkeln bei 22 °C auf 3 mM MES-Puffer (pH 5,8) gelegt. Um die durch Phytohormone induzierte Blattalterung zu untersuchen, wurden abgetrennte Blätter auf 3 mM MES-Puffer (pH 5,8), der 100 μM MeJA enthielt, bei 22 °C geschwommen und für den angegebenen Zeitraum unter schwachem Licht gehalten.

Um die gesamte Chlorophyllkonzentration zu messen, wurden die Gesamtpigmente 24 Stunden lang mit 95 % (v/v) Ethanol aus Pflanzenblättern extrahiert. Die Absorption bei 649 und 665 nm wurde mit einem Ultraviolett-/sichtbaren Spektrophotometer (SOPTOP UV2800S, Shanghai, China) gemessen. Um die Fv/Fm-Verhältnisse zu berechnen, wurden Blätter mit einem geschlossenen Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebungssystem (Photon System Instruments, Brünn, Tschechische Republik) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert, wie zuvor beschrieben31.

Für den In-vitro-Proteinabbautest wurde das Gesamtprotein aus Wildtyp- und transgenen Apfelkalli unter Verwendung von Abbaupuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM DTT, und 10 mM ATP). Die Proteinextrakte wurden mit MdZAT10-His bei 22 °C inkubiert und durch Western Blot mit einem Anti-His-Antikörper (Abmart) bewertet.

Wir führten einen In-vivo-Ubiquitinierungstest wie zuvor beschrieben64 durch. Kurz gesagt, transgene MdBT2-GFP-Kalli wurden mit einem PierceTM Classic IP Kit (Thermo Fisher) extrahiert und die Extrakte über Nacht bei 4 °C mit MdZAT10-His-Protein inkubiert. Die In-vivo-Ubiquitinierung von MdZAT10 wurde durch Western Blot mit Anti-His- (Abmart) und Anti-Ubi- (Sigma-Aldrich) Antikörpern nachgewiesen.

Zur Durchführung des transienten Expressionstests wurden die MdNYC1- und MdNYE1-Promotorsequenzen in den pGreenII 0800-LUC-Vektor eingefügt. MdZAT10 und MdABI5 voller Länge wurden in den pGreen 62-SK-Vektor kloniert. Die rekombinanten Plasmide wurden durch Agrobacterium-vermittelte Transformation in N. benthamiana-Blätter transformiert, und das LUC/REN-Aktivitätsverhältnis wurde mithilfe eines Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Systems (Promega)64 ermittelt.

Für die GUS-Färbung wurden transgene Pflanzen 12 Stunden lang in X-Gluc-Puffer (1 mM X-Gluc, 0,5 mM Ferricyanid, 0,5 mM Ferrocyanid, 0,1 mM EDTA und 0,1 % Triton X-100) bei 37 °C inkubiert. Die GUS-Aktivität wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer nachgewiesen.

Jedes Experiment in dieser Studie wurde mindestens dreimal wiederholt. Die Daten wurden per T-Test mit der Software GraphPad Prism 6.02 analysiert und Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (*P < 0,05, **P < 0,01).

Sequenzdaten aus diesem Artikel sind im Apple-Genom (DDR) zu finden: MdABI5 (LOC103430245), MdABI1 (MDP0000265371), MdABI2 (MD15G1054500), MdABI4 (MD01G1155400), MdBT1 (MDP0000151000), MdBT2 (MDP00006). 43281), MdBT3.1 ( MDP0000296225), MdBT4 (MDP0000215415), MdNYE1, (MDP0000322543), MdNYC1 (MDP0000124013), MdAZF1 (MDP0000265345), MdZAT5 (MDP0000769354), MdZAT6 (MDP000031). 9225), MdZAT10 (MDP0000198015), MdZAT11 (MDP0000305944), MdZAT14 (MDP0000204390), MdZAT16 (MDP0000137826) und MdZAT18 (MDP0000768369).

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Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31772288) und der Shandong Natural Science Major Basic Research Foundation (ZR2020ZD43) unterstützt.

National Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Collaborative Innovation Centre of Fruit & Gemüse Quality and Efficient Production, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai-An, Shandong, 271018, China

Kuo Yang, Jian-Ping An, Xue-Na Shen, Ya-Jing Liu, Da-Ru Wang, Xing-Long Ji, Yu-Jin Hao und Chun-Xiang You

National Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai-An, Shandong, 271018, China

Chong-Yang Li

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JA schlug das Projekt vor. KY führte die meisten Experimente durch und schrieb das Manuskript. XS, DW und CL konstruierten die Vektoren. YL und XJ stellten das Pflanzenmaterial und die Testmethodik zur Verfügung. YH und CY diskutierten den Artikel. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yu-Jin Hao oder Chun-Xiang You.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, K., An, JP., Li, CY. et al. Der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor MdZAT10 vom Apfel-C2H2-Typ reguliert die JA-induzierte Blattalterung durch Interaktion mit MdBT2 positiv. Hortic Res 8, 159 (2021). https://doi.org/10.1038/s41438-021-00593-0

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Eingegangen: 01. Februar 2021

Überarbeitet: 15. April 2021

Angenommen: 26. April 2021

Veröffentlicht: 01. Juli 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41438-021-00593-0

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