Eine vergleichende Transkriptomanalyse von Veratrum maackii und Veratrum nigrum zeigt mehrere Kandidatengene, die an der Biosynthese von Steroidalkaloiden beteiligt sind

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8198 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Veratrum (Melanthiaceae; Liliales) ist eine Gattung mehrjähriger Kräuter, die für die Produktion einzigartiger bioaktiver Steroidalkaloide bekannt ist. Allerdings ist die Biosynthese dieser Verbindungen noch nicht vollständig verstanden, da viele der nachgeschalteten enzymatischen Schritte noch geklärt werden müssen. RNA-Seq ist eine leistungsstarke Methode, mit der Kandidatengene identifiziert werden können, die an Stoffwechselwegen beteiligt sind, indem die Transkriptome metabolisch aktiver Gewebe mit Kontrollen verglichen werden, denen der interessierende Stoffwechselweg fehlt. Die Wurzel- und Blatttranskriptome wilder Veratrum maackii- und Veratrum nigrum-Pflanzen wurden sequenziert und 437.820 saubere Lesevorgänge zu 203.912 Unigenes zusammengesetzt, von denen 47,67 % mit Anmerkungen versehen waren. Wir identifizierten 235 unterschiedlich exprimierte Unigene, die möglicherweise an der Synthese von Steroidalkaloiden beteiligt sind. Zwanzig Unigene, darunter neue Kandidaten für Cytochrom-P450-Monooxygenasen und Transkriptionsfaktoren, wurden für die Validierung durch quantitative Echtzeit-PCR ausgewählt. Die meisten Kandidatengene wurden in Wurzeln stärker exprimiert als in Blättern, zeigten jedoch bei beiden Arten ein einheitliches Profil. Von den 20 Unigenen, die vermutlich an der Synthese von Steroidalkaloiden beteiligt sind, waren 14 bereits bekannt. Wir haben drei neue CYP450-Kandidaten (CYP76A2, CYP76B6 und CYP76AH1) und drei neue Transkriptionsfaktor-Kandidaten (ERF1A, bHLH13 und bHLH66) identifiziert. Wir schlagen vor, dass ERF1A, CYP90G1-1 und CYP76AH1 spezifisch an den Schlüsselschritten der Steroidalkaloidbiosynthese in V. maackii-Wurzeln beteiligt sind. Unsere Daten stellen die erste artübergreifende Analyse der Biosynthese von Steroidalkaloiden in der Gattung Veratrum dar und zeigen, dass die Stoffwechseleigenschaften von V. maackii und V. nigrum trotz ihrer unterschiedlichen Alkaloidprofile weitgehend erhalten bleiben.

Veratrum ist eine Gattung, die etwa 40 Arten mehrjähriger krautiger Pflanzen umfasst, die in gemäßigten Regionen der nördlichen Hemisphäre weit verbreitet sind1,2. Obwohl sie giftig sind, werden die Wurzeln mehrerer Veratrum-Arten im Zusammenhang mit der westlichen Kräuterkunde und der traditionellen chinesischen Medizin mit Vorsicht zur Behandlung von Analgesie, Entzündungen3,4, Tumoren5,6,7, bösartigen Geschwüren8 und Thrombosen1 verwendet. Die wichtigsten Wirkstoffe sind Steroidalkaloide wie Jervin (und sein Derivat Cyclopamin), Cevanin und Veratramin, die in zellbasierten Tests und Tiermodellen eine Reihe medizinisch relevanter Bioaktivitäten zeigen9,10. Die Synthese von Steroidalkaloiden in Veratrum-Arten erfordert Isoprenoideinheiten, die über die zytosolischen Mevalonat- und MEP-Wege produziert werden und über mehrere enzymatische Schritte in Squalen, dann in das zyklische Zwischenprodukt Cycloartenol und schließlich in Cholesterin umgewandelt werden11,12,13. Die Umwandlung von Cholesterin in Steroidalkaloide erfordert zwei große Genfamilien: Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYP450s) und Glykosyltransferasen (GTs)14,15,16. Viele der Enzyme, die an diesem nachgeschalteten Teil des Stoffwechselwegs beteiligt sind, sind unbekannt, ebenso wie die Transkriptionsfaktoren, die die Biosynthese von Steroidalkaloiden regulieren.

Die vergleichende Transkriptomik ist ein leistungsstarker Ansatz, der Gene identifizieren kann, die für Stoffwechselenzyme kodieren, und die Transkriptionsfaktoren, die sie regulieren, indem metabolisch aktive Gewebe mit Kontrollen verglichen werden, denen der interessierende Signalweg fehlt17,18. Die Korrelation der Metabolitenspiegel mit RNA-Seq-Daten identifizierte kürzlich vier Enzyme (einschließlich drei CYP450), die an der Biosynthese von Steroidalkaloiden in Veratrum californicum beteiligt sind19. Darüber hinaus ergab ein umfassender Vergleich der Stängel-, Blatt- und Wurzeltranskriptome von Veratrum nigrum 73 zusätzliche Kandidatengene, die an verschiedenen Teilen des Signalwegs beteiligt sind, darunter 11 Enzyme im Segment von Cycloartenol bis Cholesterin10. Hier verwendeten wir einen ähnlichen Ansatz der vergleichenden Transkriptomik, schlossen jedoch zwei Veratrum-Arten mit unterschiedlichen Steroidalkaloidprofilen ein, um interspezifische Unterschiede sowie gemeinsame Komponenten der Veratrum-Steroidalkaloid-Biosynthesewege zu untersuchen. Wir verglichen die Wurzel- und Blatttranskriptome von V. maackii und V. nigrum und validierten Unterschiede in der Genexpression durch RT-PCR. Unsere Ergebnisse stellen eine wertvolle genomische Ressource für die Entdeckung neuer Gene im Zusammenhang mit dem Steroidalkaloidstoffwechsel dar.

Frühere RNA-Seq-Experimente, die sich auf die Biosynthese von Veratrum-Steroidalkaloiden konzentrierten, berücksichtigten nur einzelne Arten und verpassten daher die Möglichkeit, interspezifische Unterschiede sowie konservierte Aspekte des Stoffwechselwegs zu untersuchen10,19. Um dieses Problem anzugehen, haben wir zwei Veratrum-Arten (V. maackii und V. nigrum) mit unterschiedlichen Alkaloidprofilen ausgewählt, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, Unterschiede in der zugrunde liegenden Genexpression zu finden. Wir haben den Gehalt an Jervin und Cyclopamin in beiden Pflanzen gemessen (Abb. 1). Jervine war in allen Proben vorhanden, kam jedoch in den Wurzeln von V. maackii signifikant (p < 0,05) häufiger vor als in den Wurzeln von V. nigrum und im Vergleich zu den Blättern beider Arten. Im Gegensatz dazu war Cyclopamin in den Wurzeln von V. nigrum signifikant häufiger (p < 0,05) als in den Wurzeln von V. maackii und im Vergleich zu den Blättern beider Arten (wo Cyclopamin kaum nachgewiesen wurde).

Steroidalkaloidgehalt von Wurzel- und Blattgeweben in V. maackii und V. nigrum. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). Schwarzer Balken: Jervin, grauer Balken: Cyclopamin. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen laut Bonferroni-Mehrfachvergleichstests auf signifikante Unterschiede (p < 0,05) hin. dw Trockengewicht, MR V. maackii-Wurzeln, ML V. maackii-Blätter, NR V. nigrum-Wurzeln, NL V. nigrum-Blätter.

Blatt- und Wurzelgewebe wurden von V. nigrum- und V. maackii-Pflanzen für die RNA-Seq-Analyse gesammelt (drei biologische Replikate von verschiedenen Pflanzen). Wir haben 79,12 Gbit/s an sauberen Lesevorgängen aus den 12 Proben erhalten (Tabelle 1). Der GC-Gehalt jeder Probe betrug mindestens 50,46 % und der Q30-Basenprozentsatz betrug 92,23 %. Nach der Verarbeitung mit der Trinity-Software wurden 437.820 Transkripte mit einer N50-Länge von 871 bp zusammengestellt und 203.912 Unigene mit einer durchschnittlichen Länge von 687 bp und einer N50-Länge von 780 bp identifiziert.

Die 203.912 Unigene wurden mit mehreren öffentlichen Datenbanken verglichen und 97.207 (47,67 %) wurden für alle Datenbanken mit Anmerkungen versehen (Tabelle 2).

In der Nr-Datenbank wiesen 86.569 Unigene (42,45 %) signifikante Übereinstimmungen auf und die homologen Arten wurden vorhergesagt. Dementsprechend wurden 10.329 (12%) und 9741 (11%) Unigene den einkeimblättrigen Pflanzen Elaeis guineensis bzw. Phoenix dactylifera zugeordnet (ergänzende Abbildung S1A). Für V. nigrum wurden 59.614 Unigene annotiert, von denen 10.083 mit homologen Sequenzen von Elaeis guineensis übereinstimmten, gefolgt von Phoenix dactylifera (9442) und Musa acuminata (3909) (Ergänzende Abbildung S1B). Für V. maackii wurden 60.387 Unigene annotiert, von denen 9618 mit homologen Sequenzen von Elaeis guineensis übereinstimmten, gefolgt von Phoenix dactylifera (8926) und Neonectria ditissima (6434) (Ergänzende Abbildung S1C).

Als nächstes wurden die 43.611 (44,86 %) annotierten Unigene in drei Kategorien der Genontologie (GO) eingeteilt: biologischer Prozess, zelluläre Komponente und molekulare Funktion (Abb. 2A). In der Kategorie biologischer Prozesse waren die drei Hauptunterkategorien „Stoffwechselprozess“ (23.391, 31,26 %), „zellulärer Prozess“ (20.911, 27,95 %) und „Lokalisierung“ (6048, 8,08 %). In der Kategorie der Zellbestandteile waren die drei Hauptunterkategorien „Zellteil“ (17.806, 23,34 %), „Zelle“ (17.662, 23,18 %) und „Organelle“ (13.609, 17,79 %). In der Kategorie der molekularen Funktionen waren die drei Hauptunterkategorien „katalytische Aktivität“ (22.517, 44,36 %), „Bindung“ (21.693, 42,73 %) und „Transporteraktivität“ (2618, 5,16 %). Separate GO-Anmerkungen für die beiden Arten spiegelten das gesamte Anmerkungsprofil wider. Für V. nigrum wurden in der GO-Datenbank 30.303 Unigene annotiert, von denen 22.263 als biologischer Prozess, 16.751 als zelluläre Komponente und 24.764 als molekulare Funktion klassifiziert wurden (Abb. 2B). Für V. maackii wurden 31.254 Unigene in der GO-Datenbank annotiert, von denen 23.191 als biologischer Prozess, 17.524 als zelluläre Komponente und 25.625 als molekulare Funktion klassifiziert wurden (Abb. 2C).

(A) GO-Klassifizierung aller zusammengesetzten V. maackii und V. nigrum unigenes; (B) GO-Klassifizierung aller zusammengesetzten V. nigrum unigenes; (C) GO-Klassifizierung aller zusammengesetzten V. maackii unigenes.

In der KOG-Datenbank wurden 54.907 (56,48 %) Eingeborene 26 Kategorien zugeordnet. Die am weitesten verbreitete Kategorie (12.685 Unigene, 23,05 %) war „nur allgemeine Funktionsvorhersage“, gefolgt von „posttranslationale Modifikation, Proteinumsatz und Chaperone“ (6064, 11,04 %) und „Signaltransduktionsmechanismen“ (5317, 9,68 %). Die am wenigsten besetzten Kategorien waren „Zellmotilität“ (41, 0,075 %) und „Kernstruktur“ (268, 0,48 %) (Abb. 3A). Auch hier spiegelten die separaten Anmerkungen für die beiden Arten das gesamte Anmerkungsprofil wider. Wir haben 35.966 KOG-Anmerkungen identifiziert, die mit V. nigrum übereinstimmen, und die am weitesten verbreitete Kategorie war „Nur allgemeine Funktionsvorhersage“ mit 8394 Unigenes (Abb. 3B). Wir identifizierten 37.395 KOG-Anmerkungen, die mit V. maackii übereinstimmten, und die am weitesten verbreitete Kategorie war „Nur allgemeine Funktionsvorhersage“ mit 9285 Unigenes (Abb. 3C).

(A) KOG-Funktionsklassifizierung von V. maackii und V. nigrum unigenes; (B) KOG-Funktionsklassifizierung von V. nigrum unigenes; (C) KOG-Funktionsklassifizierung von V. mackii unigenes.

Schließlich wurden 21.581 Unigene anhand der KEGG-Datenbank annotiert und 121 biologischen Signalwegen zugeordnet (Ergänzungstabelle S1). Unter ihnen waren 6421 (29,75 %) an Stoffwechselwegen beteiligt, darunter hauptsächlich „Ribosom“ (1847, 8,5 %), „Purinstoffwechsel“ (698, 3,23 %) und „Glykolyse/Glukoneogenese“ (666, 3,09 %) (Ergänzung). Abb. S2A). Bei jeder Art wurde eine ähnliche Anzahl von Unigenes angegeben: 14.456 bei V. nigrum und 14.815 bei V. maackii. Bei beiden Arten war die Kategorie „Stoffwechselwege“ am häufigsten vertreten (3526 bei V. nigrum und 3395 bei V. maackii), gefolgt von der Kategorie „Biosynthese sekundärer Metaboliten“ (1738 bei V. nigrum und 1708 bei V. maackii) (Ergänzende Abb . S2B, C).

Der transkriptomische Vergleich zweier Gewebe zweier Arten bietet die Möglichkeit, die Komponenten eines gewebespezifischen Stoffwechselwegs zu definieren, aber auch Unterschiede in der Genexpression zwischen Arten zu bewerten, die zu unterschiedlichen Stoffwechselprofilen führen, was in früheren Studien mit einem einzelnen nicht möglich war Veratrum-Arten10,19. Beim Vergleich der Wurzeln von V. maackii mit den Wurzeln von V. nigrum (MR vs. NR) fanden wir 3534 differentiell exprimierte Gene (DEGs), 2004 hochreguliert und 1530 herunterreguliert in V. maackii. Wichtig ist, dass 1019 Transkripte nur in MR und weitere 814 nur in NR vorhanden waren, was auf qualitative und quantitative Unterschiede im transkriptomischen Vergleich zwischen den Arten hinweist. Beim Vergleich von V. maackii-Blättern mit V. nigrum-Blättern (ML vs. NL) fanden wir außerdem 5734 DEGs, 2919 hochregulierte und 2815 herunterregulierte in V. maackii. Wie oben waren 1090 Transkripte nur in ML und weitere 902 nur in NL vorhanden.

Der Vergleich der Gewebe innerhalb der Art ergab 3269 DEGs beim Vergleich von Wurzeln und Blättern von V. maackii (MR vs. ML), 1593 hochregulierte und 1676 herunterregulierte in den Wurzeln, darunter 862 Transkripte, die nur in MR vorhanden waren, und weitere 339 nur in ML. In ähnlicher Weise ergab der Vergleich zwischen NR und NL in V. nigrum 1122 DEGs, 263 hochregulierte und 859 herunterregulierte in den Wurzeln, darunter 75 Transkripte, die nur in NR und 124 nur in ML vorhanden waren (Abb. 4). Interessanterweise wurden zwischen allen vier Probentypen keine Transkripte geteilt.

Venn-Diagramm unterschiedlich exprimierter Gene in den Wurzeln und Blättern von V. maackii und V. nigrum.

Wir haben die GO- und KEGG-Annotationen der DEGs untersucht, um etwaige artabhängige oder gewebespezifische Unterschiede in den Genfunktionen zu bestimmen. Die biologische GO-Prozesskategorie „Stoffwechselprozess“ (GO:0008152) war bei V. maackii stärker angereichert als bei V. nigrum. Die biologischen GO-Prozesskategorien „Oxidations-Reduktionsprozess“ (GO:0055114) und „rRNA-Verarbeitung“ (GO:0006364), die GO-Zellkomponenten „integrale Komponente der Membran“ (GO:0016021), „Membran“ (GO:0016020). ) und „Chloroplasten“ (GO:0009507) sowie die molekularen Funktionen „ATP-Bindung“ (GO:0005524), „Metallionenbindung“ (GO:0046872) und „Oxidoreduktase-Aktivität“ (GO:0016491) wurden in den Blättern angereichert beider Arten, jedoch nicht in den Wurzeln. Wir beobachteten große Unterschiede zwischen Blättern und Wurzeln in mehreren GO-Kategorien (Ergänzungstabelle S2).

Als nächstes identifizierten wir die angereicherten KEGG-Wege, um uns auf den Steroidalkaloidstoffwechsel zu konzentrieren (Ergänzungstabelle S3). Ungefähr 100 Signalwege wurden in den Vergleichen MR vs. NR, ML vs. NL und MR vs. ML angereichert, aber nur 50 in NR vs. NL. Dabei handelte es sich um 263, 329, 499 bzw. 185 Eingeborene. Bei MR vs. NR waren „Glykolyse/Glukoneogenese“, „Purinstoffwechsel“ und „oxidative Phosphorylierung“ mit jeweils 18 Unigenen die am stärksten angereicherten Wege. In ML vs. NL waren „Ribosom“, „Purinstoffwechsel“ und „Glykolyse/Glukoneogenese“ mit 22, 20 bzw. 19 Unigenen die am stärksten angereicherten Wege. In MR vs. ML waren die Kategorien „Photosynthese“, „Kohlenstofffixierung in photosynthetischen Organismen“ und „Phenylpropanoid-Biosynthese“ mit 58, 38 bzw. 32 Unigenen die am stärksten angereicherten Kategorien. In ähnlicher Weise waren in NR vs. NL die Kategorien „Photosynthese“, „Photosynthese-Antennenproteine“ und „Kohlenstofffixierung in photosynthetischen Organismen“ mit 46, 24 bzw. 22 Unigenen die am stärksten angereicherten Kategorien. In der hochrelevanten Kategorie „Steroidbiosynthese“ wurde die größte Anzahl an Unigenen (fünf) im Vergleich MR vs. ML gefunden, wohingegen die Unterschiede in den Vergleichen MR vs. NR und ML vs. NL unbedeutend waren (zwei Unigene). Diese Daten deuten darauf hin, dass es hinsichtlich des Steroidalkaloidstoffwechsels nur einen kleinen Unterschied zwischen den Arten gibt, aber einen großen Unterschied zwischen Blatt- und Wurzelgewebe.

Einer der Vorteile der RNA-Seq-Analyse im Zusammenhang mit Stoffwechselwegen besteht darin, dass Unterschiede in der Genexpression nicht nur Enzyme identifizieren können, die direkt am Stoffwechselweg beteiligt sind, sondern auch die regulatorischen Proteine – insbesondere Transkriptionsfaktoren (TFs), die ihn steuern. Wir konnten 867 Unigene 16 bekannten Pflanzen-TF-Genfamilien zuordnen, darunter 168 (19,36 %) der MYB-Familie, 152 (17,55 %) der bZIP-Familie, 126 (14,56 %) der bHLH-Familie, 94 (10,85 %). %) zur ERF-Familie und 92 (10,62 %) zur C2H2-Familie (Abb. 5). Wichtig ist, dass 234 der TF-Gene unterschiedlich exprimiert wurden, darunter 131 beim Vergleich von MR mit ML und 37 beim Vergleich von NR mit NL, wobei die Mehrheit in beiden Fällen die MYB-Familie repräsentierte (ergänzende Abbildung S3). Weitere 42 TF-Gene unterschieden sich beim Vergleich von MR und NR, wobei die Mehrheit die C2H2-Familie repräsentierte, gefolgt von MYB, AP2/ERF und bHLH. Darüber hinaus unterschieden sich 77 TF-Gene beim Vergleich von ML und NL, wobei die Mehrheit die Zinkfingerfamilie repräsentierte, gefolgt von bHLH, WRKY, NAC, MYB, ARF, GATA, bZIP und C2H2 (ergänzende Abbildung S4). Alle unterschiedlich exprimierten bZIP-, C2H2- und bHLH-TF-Gene waren in den Wurzeln im Vergleich zu den Blättern bei beiden Arten hochreguliert (ergänzende Abbildung S4).

Verteilung der Sequenzen zwischen den Transkriptionsfaktorfamilien V. maackii und V. nigrum.

Wir identifizierten 444 als CYP450 bezeichnete Unigene, von denen 139 keiner Familie zugeordnet werden konnten. Der Rest wurde neun Clans und 41 Familien zugeordnet (Ergänzungstabelle S5; Ergänzungstabelle S6). Die am häufigsten vorkommenden Familien waren CYP71 und CYP76, die zusammen mehr als die Hälfte der Gesamtzahl ausmachten, was mit der Verteilung der CYPs in anderen Pflanzenarten übereinstimmt20. Wir fanden heraus, dass 153 der CYP450-Unigene unterschiedlich exprimiert wurden, einschließlich der zuvor berichteten CYP90B27, CYP90G1 (zwei Unigene) und CYP94N, die möglicherweise an der Cyclopaminsynthese beteiligt sind19. Die CYP450-Unigene wurden bei beiden Arten in den Wurzeln in höheren Mengen exprimiert als in den Blättern.

Wir haben 20 Kandidatengene aus den DEGs ausgewählt, die Enzyme und TFs kodieren, die mit dem Steroidalkaloidweg assoziiert sind, und ihre Expressionsprofile durch RT-qPCR validiert. Alle 10 Kandidatengene, die für Enzyme im stromaufwärts gelegenen Teil des Steroidalkaloidwegs kodieren, wurden in den Wurzeln in höheren Mengen exprimiert als in den Blättern beider Arten (Abb. 6): 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Synthase (HMGS), 3 -Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Reduktase (HMGR), Mevalonatkinase (MK), Diphosphomevalonatkinase (PMK), Diphosphomevalonatdecarboxylase (MVD), Squalenepoxidase (SQE), Cycloartenolsynthase (CAS, zwei Unigene), Cyclopropylisomerase (CPI). ) und Sterol-14-Demethylase (CYP51). In ähnlicher Weise wurden alle sieben CYP450-Kandidatengene in Wurzeln stärker exprimiert als in Blättern: CYP90G1 (zwei Unigene), CYP90B27, CYP94N, CYP76A2, CYP76B6 und CYP76AH1 (Abb. 7). Schließlich wurden unter den drei von uns getesteten TF-Genen ERF1A und bHLH66 stärker in den Wurzeln exprimiert, während bHLH13 stärker in den Blättern exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass letzteres ein negativer Regulator sein könnte (Abb. 7). Die RT-qPCR-Ergebnisse stimmten mit den RNA-Seq-Daten für die meisten Kandidatengene überein, mit der Ausnahme, dass MVD in NL stärker exprimiert wurde als NR und CAS2 in ML stärker exprimiert wurde als MR.

Analyse von 10 unterschiedlich exprimierten Genen, die für Enzyme kodieren, die an der MVA- und Steroidalkaloidsynthese im Wurzel- und Blattgewebe von V. maackii und V. nigrum beteiligt sind, validiert durch qRT-PCR.

Analyse von sieben CYP50-Genen und drei Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise an der Steroidalkaloidsynthese beteiligt sind, validiert durch qRT-PCR.

Veratrum-Pflanzen produzieren eine reiche Vielfalt an Steroidalkaloiden, von denen viele von pharmazeutischem Interesse sind, und die Alkaloidprofile verschiedener Arten sind einzigartig. Beispielsweise umfasst das Steroidalkaloidprofil von V. californicum die signifikante Anreicherung von Cyclopamin in Rhizomen, gefolgt von Wurzeln und Zwiebeln, was zu einem 20-fachen Unterschied zwischen unterirdischen und oberirdischen Organen führt19. Dies deutet darauf hin, dass Steroidalkaloide in V. californicum in unterirdischen Organen synthetisiert und in andere Teile der Pflanze transportiert werden. Der Vergleich der Wurzeln und Blätter von V. californicum ergab einen 20- bis 100-fach höheren Gehalt an Cyclopamin in den Wurzeln21,22, dieser variiert jedoch erheblich je nach Ernteort und Wachstumsstadium22. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass sich in den Wurzeln von V. nigrum doppelt so viel Jervin ansammelt wie in den Blättern23. Als Grundlage für unsere RNA-Seq-Experimente haben wir diese Analyse erweitert, um mehrere Alkaloide und mehrere Arten einzubeziehen. Wir fanden heraus, dass V. nigrum und V. maackii entgegengesetzte Profile für die Anreicherung von Jervin und Cyclopamin aufwiesen, wobei sich Jervin in den Wurzeln von V. maackii im Vergleich zu den Blättern und in den Wurzeln und Blättern von V. nigrum in viel höheren Mengen anreicherte, während dies bei Cyclopamin der Fall war kommt in den Wurzeln von V. nigrum häufiger vor als bei V. maackii und wurde in den Blättern beider Arten nicht nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass V. nigrum und V. maackii gute Modelle für die Analyse interspezifischer Unterschiede in der Alkaloidakkumulation sind, die auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein könnten, darunter unterschiedliche Genexpression, Proteinsynthese/-stabilität, Enzymaktivität und/oder Produktumsatz. Wie oben erwähnt, wird die Anreicherung von Alkaloiden durch Umweltfaktoren beeinflusst und variiert je nach Wachstumsstadium und Jahreszeit. In den meisten Studien wird die Erntesaison des untersuchten Materials nicht erwähnt, aber unsere Studie bestätigt das für Cyclopamin in V. californicum beobachtete Muster, bei dem die unterirdischen Organe im Allgemeinen höhere Alkaloidkonzentrationen ansammeln als die oberirdischen Organe19,22. Bei Jervine trifft dies auf V. maackii zu, bei V. nigrum ist das Verhältnis jedoch ausgeglichener. Es scheint eine Tendenz zu geben, dass sich bei Veratrum-Arten in den gemäßigten Zonen gegen Herbst mehr Alkaloide ansammeln. Unsere Daten basieren jedoch auf einer einzigen Sammlung im zeitigen Frühjahr, die lediglich eine Momentaufnahme darstellt, und es liegen Informationen über die Dynamik der Alkaloidansammlung in V. maackii und V. nigrum vor fehlen. Spezifische Umweltreize, die zur Stimulierung der Alkaloidbiosynthese führen, sind unbekannt, aber Hauptregulatoren wie die identifizierten Transkriptionsfaktoren spielen wahrscheinlich eine zentrale Rolle in der Signalkaskade.

Wir haben separate Transkriptombibliotheken für Wurzel- und Blattgewebe in V. nigrum und V. maackii zusammengestellt, um eine vergleichende transkriptomische Analyse der gewebespezifischen und artabhängigen Genexpression im Kontext der Steroidalkaloidbiosynthese zu ermöglichen. Dies erweitert die Analyse von V. nigrum durch Szeliga et al.10, obwohl sie drei separate Gewebe (Wurzel, Blatt und Stiel) betrachteten. Die Einbeziehung von zwei Luftgeweben verfeinert die Analyse, aber die wichtigsten relevanten Unterschiede, die sich aus ihrer Arbeit ergaben, betrafen die zwischen den Wurzeln und anderen Geweben. Daher haben wir unsere Analyse auf Wurzeln und Blätter beschränkt, um die Anzahl der Transkriptomdatensätze zu reduzieren. Diese Vereinfachung ermöglichte es uns, im Vergleich zur Szeliga-Studie größere Transkriptombibliotheken zu erstellen und zu analysieren, was zur Isolierung von 132.155 bzw. 109.287 Unigenen in der Wurzel und im Blatt von V. nigrum führte (ergänzende Abbildung S5A) sowie 124.802 und 101.035 in die Wurzel und das Blatt von V. maackii (ergänzende Abbildung S5B). In NR, NL, MR und ML fanden wir 43.608, 20.740, 43.927 bzw. 20.160 Unigene (Ergänzende Abbildung S5A, B).

Szeliga und Kollegen kommentierten ihre Transkriptomdatensätze und fanden in den Blättern mehr annotierte Unigene als in den Wurzeln10. Im Gegensatz dazu fanden wir in den Wurzeltranskriptomen beider Arten mehr annotierte Unigene (Ergänzungstabelle S7). Beide Studien fanden die größte Anzahl an Anmerkungen in der Nr-Datenbank. Wir konnten 64.329 (66 %) Unigene in MR, 43.151 (44 %) in ML, 61.428 (63 %) in NR und 46.139 (47 %) in NL annotieren. Wir haben auch weitere Unigene identifiziert, die in KEGG (21.581) annotiert werden könnten. Die Unterschiede zwischen unseren Ergebnissen und denen in der früheren Studie zu V. nigrum können auf die unterschiedlichen Quellen der Pflanzen (Wildpflanzen in unserer Studie, aber im Labor gezüchtete Pflanzen in der früheren Studie10) und/oder Unterschiede im Zeitpunkt der Pflanzensammlung zurückzuführen sein Probenahme.

Maximal 12 % der Unigene hatten homologe Übereinstimmungen mit einzelnen anderen Arten. Dieser Wert ist zu niedrig, um eine enge phylogenetische Verwandtschaft zu belegen. Eine Verwandtschaft innerhalb von Monokotyledonen ist jedoch klar erkennbar. Kulturpflanzen sind in Datenbanken im Allgemeinen gut vertreten und daher sollten die besten Treffer, Elaeis guineensis und Phoenix dactylifera, nicht überbewertet werden. Eine frühere Studie zu V. nigrum10 weist auf Übereinstimmungen mit Oryza sativa hin, einer einkeimblättrigen Nutzpflanze, der es ebenfalls an Steroidalkaloiden mangelt.

Die Biosynthese von Steroidalkaloiden kann in drei Stufen unterteilt werden: den vorgelagerten MVA-Weg, der 2,3-Oxidosqualen produziert, die Umwandlung von Cycloartenol in Cholesterin und die Umwandlung von Cholesterin in Steroidalkaloide (Abb. 8)24,25. Die erste Stufe umfasst sechs Schlüsselenzyme (HMGS, HMGR, MK, PMK, MVD und SQE) und wir haben die entsprechenden Gene gescreent, die auch von Szeliga et al.10 identifiziert wurden. Wir fanden heraus, dass die meisten dieser Gene in Wurzeln stark exprimiert wurden, mit MVD als einziger Ausnahme (Abb. 6). HMGR ist ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt im MVA-Weg und katalysiert die Umwandlung von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A (HMGR-CoA) in Mevalonat (MVA)26. HMGR wurde bei beiden Arten in Wurzeln stärker exprimiert als in Blättern, wie hier und zuvor10 durch qRT-PCR bestätigt. Die zweite Stufe der Steroidalkaloidsynthese umfasst drei Gene, die die Enzyme CAS, CPI und CYP51 kodieren. Wir fanden heraus, dass CPI und CYP51 in den Wurzeln beider Arten in höheren Konzentrationen exprimiert wurden als in den Blättern (Abb. 6). CPI katalysiert die Umwandlung von 31-Norcycloartanol in 31-Nor-24(25)-dihydrolanosterol und CYP51 katalysiert die 14α-Demethylierung während der anfänglichen Reaktion der pflanzlichen Sterolbiosynthese27. Sowohl CPI als auch CYP51 sind an der Cholesterinbiosynthese in Nachtschattengewächsen beteiligt25. Wichtig ist, dass Cycloartenol als das erste zyklische Zwischenprodukt in der Biosynthese von Steroidalkaloiden gilt, bei Arabidopsis thaliana wurde jedoch ein alternativer Weg vorgeschlagen, der die Umwandlung von 2,3-Oxidosqualen in Lanosterol beinhaltet. Das Fehlen annotierter Transkripte, die für die Lanosterol-Synthase in unserem Datensatz kodieren, legt nahe, dass dieser alternative Weg nicht vorhanden ist oder in V. nigrum und V. maackii vorhanden, aber stummgeschaltet ist, was bestätigt, dass Steroidalkaloide in diesen Arten aus Cycloartenol synthetisiert werden 25, 28.

Cyclopamin-Biosyntheseweg. AACT Acetyl-CoA C-Acetyltransferase, Acetoacetyl-CoA Acetoacetyl-Coenzym A, Acetyl-CoA Acetyl-Coenzym A, HMGCoA:3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA, HMGS Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase, HMGR 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Reduktase, MVA-Mevalonat, MK-Mevalonatkinase, MVAP-Mevalonat-5-phosphat, PMK-Phosphomevalonatkinase, MVD-Diphosphomevalonat-Decarboxylase, MVAPP-Mevalonat-5-diphosphomevalonat, IPP-Isopentenyldiphosphat, GPS-Geranylgeranyldiphosphat-Synthase, GPP-Geranyldiphosphat, FDS-Farnesyldiphosphat-Synthase, FPP-Farnesyldi Phosphat, SQS Squalensynthetase, SQE Squalenepoxidase, CAS Cycloartenolsynthase, SSR2 Sterolseitenkettenreduktase 2, SMO3 C-4 Sterolmethyloxidase 3, CPI Cyclopropylsterolisomerase, CYP51 Sterol C-14 Demethylase, C14-R Sterol C-14 Reduktase, CYP51 Sterol C -14-Demethylase, SMO4 C-4-Sterol-Methyloxidase 4, C5-SD 2 Sterol-C-5(6)-Desaturase 2, 7-DR2 7-Dehydrocholesterin-Reduktase 2, CYP90B27 Cholesterin-22-Hydroxylase, CYP94N1 22-Hydroxycholesterin-26-Hydroxylase/ Oxidase, GABAT1 22-Hydroxycholesterin-26-al-Transaminase, CYP90G1 22-Hydroxy-26-aminocholesterin 22-Oxidase.

Um TFs zu identifizieren, die den Stoffwechsel in V. maackii und V. nigrum29 regulieren, haben wir annotierte Unigene untersucht, die verschiedene TF-Familien repräsentieren, und festgestellt, dass MYB, bZIP, bHLH, AP2/ERF und C2H2 am häufigsten vorkommen. Die Rangfolge unterschied sich geringfügig zwischen den beiden Arten (V. maackii – MYB, C2H2, bZIP, bHLH, WRKY, NAC und AP2/ERF; V. nigrum – MYB, bZIP, WRKY, C2H2, AP2/ERF, GATA und bHLH) und unterschieden sich auch von den Ergebnissen von Szeliga und Kollegen (bHLH, C2H2, HD-ZIP, MYB und C3H), bei denen die bHLH-Familie nur in Stiel- und Wurzelgeweben gefunden wurde, während die C2H2-Familie nur in den Blättern gefunden wurde10. Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass die bHLH- und C2H2-Familien in Wurzeln und Blättern exprimiert wurden und in Wurzeln im Vergleich zu Blättern hochreguliert waren. Diese Diskrepanz spiegelt möglicherweise die oben diskutierten Unterschiede in den Pflanzenquellen und/oder die größere Anzahl von Unigenen wider, die in unserer Studie entdeckt wurden.

Wir haben drei TF-Gene für die Validierung durch qRT-PCR ausgewählt. Das erste war AP2/ERF, das in den Wurzeln beider Arten in deutlich höheren Konzentrationen als in den Blättern exprimiert wurde und auch in V. maackii im Vergleich zu V. nigrum-Wurzeln in deutlich höheren Konzentrationen exprimiert wurde (MR vs. NR), wohingegen es eine Nichtsignifikanter interspezifischer Unterschied in den Blättern (ML vs. NL). Das AP2/ERF-Protein GAME9 ist ein TF in Nachtschattengewächsen, der mit SIMYC2 interagieren kann, um die Expression von Upstream-Genen wie C5-SD (kodierend für D(7)-Sterol-C5(6)-Destaurase) zu regulieren und so die Synthese von zu regulieren Glykosidalkaloide30. Es ist möglich, dass AP2/ERF in Veratrum-Pflanzen eine ähnliche Rolle spielt. Die starke Korrelation zwischen der ERF1A-Expression und dem Cyclopamingehalt von Wurzeln und Blättern bei beiden Arten legt nahe, dass ERF1A spezifisch die Synthese von Cyclopamin in V. maackii-Wurzeln reguliert. Die anderen beiden Kandidaten sind Mitglieder der bHLH-Familie, von der bekannt ist, dass sie die Synthese von Flavonoiden und Alkaloiden reguliert31. Wir fanden heraus, dass bHLH13 und bHLH66 in den Wurzeln von V. maackii am stärksten hochreguliert waren und dass bHLH66 in den Wurzeln beider Arten signifikant (p < 0,05) häufiger vorkam als in den Blättern, insbesondere aber in V. maackii (Abb. 7). Wir spekulieren, dass beide TFs die Biosynthese von Steroidalkaloiden regulieren könnten. Die starke Korrelation zwischen der Expression dieser beiden TFs und dem Steroidalkaloidgehalt deutete darauf hin, dass bHLH13 die Cyclopaminsynthese regulieren könnte, während bHLH66 die Umwandlung von Cyclopamin in Jervin regulieren könnte. Nur wenige frühere Studien haben sich mit der Transkriptionsregulation der Steroidalkaloid-Biosynthese in V. nigrum befasst10, 19 und keine (unserem Wissen) in V. maackii, daher sollten diese drei Kandidaten in zukünftigen Studien detaillierter untersucht werden, um ihre genaue Rolle zu bestimmen.

Die CYP450-Familie ist die größte Enzymfamilie im Pflanzenstoffwechsel und spielt eine Schlüsselrolle bei der Diversifizierung und funktionellen Modifikation von Triterpenoid- und Sterolgerüsten32,33. Wir untersuchten sieben unterschiedlich exprimierte CYP450-Gene, die möglicherweise an der Steroidalkaloid-Biosynthese beteiligt sind. Drei davon (CYP90B27, CYP90G1 und CYP94N1) katalysieren die Umwandlung von Cholesterin in nachgeschaltete Zwischenprodukte. CYP90B27 wandelt Cholesterin in 22(R)-Hydroxycholesterin um, das durch CYP94N1 in zwei Schritten zu 22-Hydroxycholesterin-26-al oxidiert wird. Ein anderes Enzym (GABAT1) wandelt 22-Hydroxycholesterin-26-al in 22-Hydroxyl-26-aminocholesterin um, das wiederum durch CYP90G1 in 22-Keto-26-aminocholesterin umgewandelt wird (Abb. 8). Wir fanden heraus, dass die Transkripte für CYP90G1, CYP94N und CYP90B27 in den Wurzeln von V. maackii und V. nigrum signifikant häufiger vorkamen (p < 0,05) als in den Blättern (Abb. 7), was mit früheren Berichten übereinstimmt19. Die starke Korrelation zwischen der CYP90G1-1-Expression und dem Steroidalkaloidgehalt der Gewebe bei beiden Arten deutete darauf hin, dass CYP90G1-1 das Schlüsselenzym für die Steroidalkaloidbiosynthese in V. maackii-Wurzeln sein könnte (Abb. 1 und 7). Aufgrund der Anreicherung von Steroidalkaloiden34 ist die Wurzel der wichtigste medizinische Bestandteil der Veratrum-Pflanze. Es wird daher angenommen, dass Enzyme, die für die Dekoration des Alkaloidskeletts verantwortlich sind, überwiegend in den Wurzeln exprimiert werden. Drei weitere CYP450-Unigene (CYP76A2, CYP76B6 und CYP76AH1) mit starker Expression in den Wurzeln gemäß RNA-Seq-Daten wurden durch qRT-PCR validiert (Abb. 7).

In der dritten Stufe der Steroidalkaloidsynthese sind die Enzyme, die 22-Keto-26-aminocholesterin in Cyclopamin umwandeln, im Allgemeinen unbekannt (Abb. 9). Verazin, die vorhergesagte Vorstufe von Cyclopamin, entsteht höchstwahrscheinlich durch die spontane Cyclisierung von 22-Keto-26-aminocholesterin, einem reaktiven Zwischenprodukt. Verazin durchläuft möglicherweise eine 16a-Hydroxylierung, um durch 16DOX katalysiert Ethiolin zu bilden, und wird dann zu Teinemin reduziert und in Gegenwart von Licht in Solanidin umgewandelt. Solanidin wird zu Epirubijervin oxidiert und in Gegenwart von Licht zu Husukinidin reduziert. Letzteres wird dann durch weitere Oxidationsreaktionen in Cyclopamin und weiter in Jervin umgewandelt oder zu Veratramin reduziert11,35,36,37,38,39,40,41. Angesichts der Korrelation zwischen der CYP450-Expression und der Verteilung von Steroidalkaloiden spekulieren wir, dass diese Enzyme auch am letzten Teil des Biosynthesewegs von Steroidalkaloiden beteiligt sind. Die starke Korrelation zwischen der CYP76AH1-Expression und dem Steroidalkaloidgehalt der Gewebe beider Arten legt nahe, dass CYP76AH1 spezifisch am letzten Abschnitt der Steroidalkaloidbiosynthese in V. maackii-Wurzeln beteiligt ist (Abb. 1 und 7). Die genauen Funktionen der drei neuen Kandidatengene CYP76A2, CYP76B6 und CYP76AH1 im letzten Teil des Steroidalkaloid-Biosynthesewegs sollten detaillierter untersucht werden.

Vorgeschlagener Weg für die Umwandlung von 22-Keto-26-aminocholesterin in Cyclopamin in Veratrum-Pflanzen.

Zusammenfassend haben wir die RNA-Seq-Analyse und die Quantifizierung spezifischer Steroidalkaloide in zwei Geweben von zwei Veratrum-Arten kombiniert, um die schnelle Identifizierung von Genen zu erleichtern, die für Enzyme und Transkriptionsfaktoren im Zusammenhang mit dem Sekundärstoffwechsel in einer Gattung von Nicht-Modell-Heilpflanzen kodieren. Wir identifizierten 97.207 V. nigrum- und V. maackii-Unigene, die mithilfe der Nr-, GO-, KOG- und KECG-Datenbanken annotiert wurden, darunter 3534 Gene, die zwischen Geweben oder zwischen Arten unterschiedlich exprimiert wurden. Wir fanden heraus, dass 235 unterschiedlich exprimierte Unigene Enzyme kodierten, die möglicherweise eine Rolle bei der Biosynthese von Steroidalkaloiden spielen. Zwanzig Unigene, die vermutlich an der Synthese von Steroidalkaloiden beteiligt sind, darunter 14 bekannte Gene, drei neue Kandidatengene, die für CYP450s kodieren (CYP76A2, CYP76B6 und CYP76AH1), und drei neue Kandidatengene, die für TFs kodieren (ERF1A, bHLH13 und bHLH66), wurden durch vergleichende Transkriptomanalyse schnell identifiziert . Wir schlagen vor, dass ERF1A, CYP90G1-1 und CYP76AH1 spezifisch an den Schlüsselschritten der Steroidalkaloidbiosynthese in V. maackii-Wurzeln beteiligt sind. Unsere Daten stellen eine wertvolle Referenz für die Untersuchung der Biosynthesewege von Steroidalkaloiden bei Veratrum-Arten dar und helfen dabei, die Gene zu identifizieren, die am Hauptbiosyntheseweg beteiligt sind, und auch diejenigen, die für die artabhängigen Steroidalkaloidprofile verantwortlich sind.

Im April 2018 wurden wilde V. nigrum- und V. maackii-Pflanzen auf dem Berg Changbai in der chinesischen Provinz Jilin gemäß den „Staatlichen Vorschriften zum Wildpflanzenschutz (Nr. 687, 2017)“ gesammelt. Die Art wurde von einem Botaniker (An Haicheng) bestätigt und die Belege wurden im Herbarium des Jiujiang Forestry Institute, Provinz Jiangxi, VR China, hinterlegt (Nummern: AN0517, AN0587) (Abb. 10). Wurzeln und Blätter wurden für die Steroidalkaloidanalyse und Transkriptomsequenzierung verwendet. Pflanzenproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann vor der RNA-Isolierung bei –80 °C gelagert. Die entsprechenden Proben wurden lyophilisiert und zur Steroidalkaloidextraktion pulverisiert.

Veratrum nigrum und Veratrum maackii wurden auf dem Changbai-Berg in der chinesischen Provinz Jilin gesammelt. (a–c) Veratrum nigrum-Pflanzen; (d–f) Veratrum macchi-Pflanzen. Gutscheine wurden im Herbarium des Jiujiang Forestry Institute, Provinz Jiangxi, China, hinterlegt (Nummern: AN0517, AN0587).

Wir haben 10 g der lyophilisierten und pulverisierten Probe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 ml 80%igem Ethanol und dann 2 Stunden lang in 95%igem Ethanol (1:4 Gew./Vol.) bei 80 °C unter kontinuierlichem Rühren eingeweicht. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration gesammelt. Der Probenrückstand wurde unter den gleichen Bedingungen erneut in 95 % Ethanol (1:10 w/v) extrahiert. Dieser Vorgang wurde ein drittes Mal wiederholt. Die drei Filtrate wurden vereinigt, das Ethanol durch Verdampfen entfernt und der Extrakt dann zur anschließenden Analyse in Methanol gelöst. Die Konzentrationen von Jervin und Cyclopamin im Extrakt wurden durch HPLC-UV unter Verwendung von kommerziellem Cyclopamin und Jervin (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) als Referenzverbindungen bestimmt42.

Alle Proben wurden dreifach analysiert. Für die statistische Analyse und Darstellung wurde SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc., San Jose, USA) verwendet. Signifikante Unterschiede im Alkaloidgehalt im Wurzel- und Blattgewebe der Arten wurden durch ANOVA identifiziert. Mehrbereichsvergleiche wurden mithilfe von Bonferroni-Mehrfachvergleichstests durchgeführt und unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05).

Die Gesamt-RNA wurde aus den 12 Proben mit Trizol-Reagenz extrahiert. Die Qualität und Quantität der RNA wurde mit einem NanoPhotometer-Spektrophotometer bewertet und die RNA-Integrität wurde durch 1 % Agarosegelelektrophorese untersucht. Der Bibliotheksaufbau und die RNA-Seq-Analyse wurden von Shanxi Boride Biotechnology unter Verwendung der Illumina HiSeq 2500-Plattform durchgeführt. Qubit2.0 und Agilent 2100 wurden zur Bestimmung der Bibliothekskonzentration und Insertgröße verwendet, und qPCR wurde zur Bibliotheksquantifizierung und Qualitätskontrolle verwendet. Trinity wurde zum Zusammenstellen der Transkriptsequenzen verwendet.

BLAST (E-Wert < 1 × 10–5)43 wurde verwendet, um Unigene mit mehreren Protein- und Nukleotiddatenbanken abzugleichen: Nr (RefSeq nicht-redundante Proteine)44, GO (Gene Ontology)45, COG (Clusters of Orthologous Groups)46 , KOG (euKaryotic Orthologous Groups)47, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)48, Pfam (Proteinfamilie)49, TrEMBL50 und SWISS-PROT51.

DEGs wurden mit DESeq52 identifiziert. Die Falscherkennungsrate (FDR) wurde zur Bestimmung des p-Wert-Schwellenwerts verwendet. Als Screeningkriterien zur Identifizierung von DEGs zwischen Probenpaaren wurden ein FDR < 0,01 und ein Fold Change (FC) ≥ 2 angewendet.

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Integrated First Strand cDNA Synthesis Kit (DiNing, Peking, China) revers in cDNA transkribiert. Die Expressionsniveaus von Unigenen, die vermutlich an der Sterolsynthese beteiligt sind, wurden durch RT-qPCR unter Verwendung der in Tabelle S1 (Ergänzungstabelle S8) aufgeführten Primersequenzen überwacht. Die RT-qPCR-Analyse wurde mit einem Roche LightCycler480 Echtzeit-PCR-System unter Verwendung von SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Tokio, Japan) durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 10 Minuten und 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden, 58 °C für 1 Minute. Das Actin (ACT)-Gen wurde als interne Referenz verwendet und das relative Expressionsniveau jedes Unigens wurde unter Verwendung der 2−ΔΔCt-Methode53 bestimmt.

Die Proben wurden von einem akkreditierten Botaniker (An Haicheng) gemäß den „Regulations of the State on Wild Plant Protection (No 687, 2017)“ gesammelt und die Gutscheine wurden im Herbarium des Jiujiang Forestry Institute, Provinz Jiangxi, VR China, hinterlegt (Nummern : AN0517, AN0587).

Alle wesentlichen Daten zu diesem Manuskript werden als Zusatzdaten und in Online-Repositories unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA912756 zur Verfügung gestellt.

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Die Autoren danken Dr. Liu Jingying für kritische Kommentare, Herrn An Haicheng für die Sammlung und Bestimmung der Veratrum-Arten und Dr. Richard Twyman für das Korrekturlesen und Bearbeiten.

Die Finanzierung erfolgte durch das Jilin Provincial Agricultural Science & Technology Innovation Project (Fördernummer CXGC202105GH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dan Wang, Zhijing Yu und Meng Guan.

Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun, 130033, Provinz Jilin, Volksrepublik China

Dan Wang, Zhijing Yu, Qinan Cai, Jia Wei und Rui Ma

VTT Technical Research Centre of Finland Ltd., PO Box 1000, 02044 VTT, Espoo, Finnland

Kirsi-Marja Oksman-Caldentey & Heiko Rischer

College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling, 712100, Volksrepublik China

Pengda Ma

Schlüssellabor für die Wiederherstellung der Saline-Alkali-Vegetationsökologie, Bildungsministerium, Hochschule für Biowissenschaften, Northeast Forestry University, Hexing Road 26, Harbin, Volksrepublik China

Meng Guan & Zheyong Xue

Hochschule für Agrarwissenschaften, Yanbian-Universität, Yanji, 133000, Provinz Jilin, Volksrepublik China

Und Geld

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ZY, LS und QC sammelten Veratrum-Pflanzen und führten HPLC durch. DW und ZY führten eine Q-PCR durch, GM, PM und ZX führten eine Datenanalyse durch. DW, RM und PM haben den Originalentwurf verfasst, KMOC und HR haben das Manuskript entworfen, überprüft und bearbeitet. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Rui Ma oder Heiko Rischer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, D., Yu, Z., Guan, M. et al. Eine vergleichende Transkriptomanalyse von Veratrum maackii und Veratrum nigrum zeigt mehrere Kandidatengene, die an der Biosynthese von Steroidalkaloiden beteiligt sind. Sci Rep 13, 8198 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35429-5

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Eingegangen: 14. Januar 2023

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 21. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35429-5

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